摘要：本文旨在研究发酵过程中产生的乙酸对重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET15b-TreS的生长以及重组海藻糖合酶基因表达的影响，并对其作用机理进行探讨。
通过外源添加乙酸（钠）的方法，研究了乙酸钠对重组菌BL21（DE3）/pET15b-TreS生长曲线的影响；利用环境扫描电子显微镜，观察了重组菌形态的变化情况；通过测定菌液的电导率值变化、菌液上清中OD260的变化，研究了乙酸（钠）对菌体细胞膜渗透性、完整性的影响；通过测定菌液上清中β-半乳糖苷酶的活性检测了乙酸钠对菌体细胞内膜的影响；利用荧光分析法检测了乙酸对菌体膜蛋白构象的影响；采用SDS-PAGE电泳研究了乙酸钠对菌体重组海藻糖合酶表达量的影响。结果表明，乙酸（钠）会对重组菌的生长产生一定的抑制作用，可以导致菌体细胞的表面出现凹陷、皱缩；并会影响细胞膜的渗透性、完整性，使得一些细胞内容物发生泄漏；影响细胞膜上的膜蛋白构象，对膜的结构造成一定程度的破坏；对重组海藻糖合酶的表达产生影响。乙酸（钠）对重组菌菌体的生长及重组海藻糖合酶基因的表达有影响，并且菌体细胞膜是其作用的一个靶点。
目前，随着重组DNA技术与发酵培养技术的迅速发展，利用基因工程菌获得所需产品的技术日趋成熟。由于大肠杆菌具有遗传特性较清楚、易培养、发酵周期短并能实现目的基因的高效表达等特性，因而被广泛应用于基因工程菌的构建。而重组菌的高细胞密度发酵是获得高外源蛋白产量的一种重要手段，能够提高单位时间单位体积的外源蛋白产率，重组大肠杆菌的高密度培养一般指培养液中菌体干细胞重量（dry cell weight，DCW）达50 g/L以上。利用重组大肠杆菌进行高密度发酵可以有效地提高外源基因表达产物的产量，但是，大肠杆菌在进行高密度发酵时会产生代谢副产物乙酸，Han认为细菌在低比生长速率条件下通过氧化代谢作用产生的能量足以满足合成和异化作用的需求，不会产生乙酸，而在高比生长速率时，大肠杆菌仅靠氧化代谢不能提供足够的能量，必须通过乙酸生成途径储备ATP和NADH2。乙酸的生成需要两个关键性的酶，磷酸转乙酰酶（Pta）和乙酰激酶（Ack），它们催化葡萄糖代谢中从乙酰辅酶A生成乙酸的两步酶促反应。然而，乙酸的产生和积累不仅会影响菌体生长，还会对菌体生长和重组基因的表达产生抑制。
EL-Mansi和Luli假设的乙酸抑制机理为：乙酸在中性pH环境中以离子化（CH3COO-）和质子化（CH3COOH）两种形式存在，质子化的乙酸具有弱的亲脂性可以穿过细胞质膜进入胞内，在胞内（pH7.5）解离成CH3COO-和H+，这样就降低了膜内的pH值，使膜内外的pH差（ΔpH）减小，减弱了质子推动力，产生的能量就被大大减少了，扰乱了细胞的正常代谢和生理活性。而阴离子增加了细胞内部渗透压，并干扰甲硫氨酸的合成。有试验证明，培养时pH越低，乙酸未解离形式含量越高，乙酸抑制作用就越强。
此外，研究表明，乙酸会影响数种蛋白和基因，特别是那些涉及大肠杆菌转录及翻译机制、一般应激反应和调节的蛋白和基因。而且，乙酸对产重组蛋白的细胞抑制作用比对野生型的细胞抑制作用更强，同时细胞诱导表达蛋白后产生乙酸的临界比生长速率更低。
在利用重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET15b-TreS进行高密度发酵生产海藻糖合酶的过程中，发酵液中会有大量代谢副产物乙酸的积累，而且会影响海藻糖合酶的酶活。根据这些检测结果，本研究采取外源添加的方法，研究乙酸对重组大肠杆菌的生长及外源海藻糖合酶基因表达的影响，并分析其对细胞的抑制机理，包括对细胞膜、目的蛋白表达量的抑制作用，旨在为了解发酵过程中乙酸对菌体作用的机理，以控制培养条件，降低对菌体生长及产物产量的影响。
高密度发酵的过程中乙酸抑制重组大肠杆菌生长及外源基因的表达——摘要
高密度发酵的过程中乙酸抑制重组大肠杆菌生长及外源基因的表达——材料与方法
高密度发酵的过程中乙酸抑制重组大肠杆菌生长及外源基因的表达——结果
高密度发酵的过程中乙酸抑制重组大肠杆菌生长及外源基因的表达——讨论、结论