2结果
2.1绿脓杆菌噬菌体的分离与纯化
通过双层平板法分离得到一株噬菌体,命名为phage30。纯化3代后,得到单一均匀圆形、清晰透明,边缘光滑,直径为1～2 mm的噬菌斑(图1)。测得其效价为4.3×1010PFU/mL。
图1噬菌体phage30的噬菌斑形态
2.2噬菌体的电镜观察透射电镜观察
phage30,由明显的头部和尾部构成。头部呈正二十面体,直径约60 nm,尾部长约180 nm,不可伸缩(图2)。按照国际病毒分类委员会分类标准,属于有尾噬菌体目,长尾噬菌体科。
图2噬菌体phage30的电镜形态
2.3噬菌体裂解谱的测定
点样法测定噬菌体phage30的裂解谱,结果表明,27株绿脓杆菌中噬菌体phage30能够裂解8株绿脓杆菌,裂解率为29.63%(8/27)。
2.4噬菌体敏感性的测定
2.4.1噬菌体phage30的pH值稳定性测定试验测定得到的phage30的pH值稳定性曲线,见图3。由图3可知,当pH值为5～11时,噬菌体phage30效价基本保持不变；当pH值＜5或pH值＞11时,噬菌体phage30的裂解活性迅速下降。另外,噬菌体phage30在同一pH值条件下作用时间对噬菌体的裂解活性影响不大。因此当pH值为5～11时,噬菌体活性稳定。
图3噬菌体phage30的pH值稳定性
2.4.2噬菌体phage30热稳定性测定
试验测定得到的phage30的热稳定性曲线,见图4。噬菌体phage30在40℃条件下,其效价基本保持不变,维持在1010以上；当温度高于50℃时随着作用时间的增长,其效价明显呈数量级下降,裂解活性迅速减弱甚至失活。因此,当温度在40℃以下的时候,噬菌体phage30活性保持较好。
图4噬菌体phage30的热稳定性
2.5噬菌体最佳感染复数的测定
噬菌体phage30最佳感染复数测定结果见表1。由表1可知,当MOI=0.01时,噬菌体phage30的效价最高达到2.3×1010PFU/mL。根据结果计算噬菌体phage30的最佳感染复数为0.01。
2.6噬菌体一步生长曲线的测定
测定得到噬菌体phage30的一步生长曲线见图5。由图5可知,噬菌体phage30的潜伏期约为60 min,爆发期约为120 min,裂解量约为156。
表1噬菌体phage30最佳感染复数的测定
图5一步生长曲线
3讨论
自然界中噬菌体的数量庞大可达1031,分布范围广。由于细菌耐药性的广泛存在,噬菌体作为细菌的天敌,具有作为抗生素替代品的开发潜力,近年来备受关注。
本研究成功筛选到1株绿脓杆菌噬菌体对其形态及生物学特征进行了鉴定。电镜形态观察确定噬菌体phage30由二十面体的头部和不可伸缩的尾部组成,属于有尾噬菌体目,长尾噬菌体科。噬菌体phage30的最佳感染复数为0.01,表明噬菌体phage30可以在较低浓度时有效裂解宿主菌,裂解性能高、杀菌效果好,这与徐彬等报道的铜绿假单胞菌噬菌体D204的最佳感染复数一致。不同的绿脓杆菌噬菌体其潜伏期、裂解量存在较大差异。郭棵棵等分离到的绿脓杆菌噬菌体PaP6的潜伏期为10 min,暴发期为50 min,裂解量为10；李亚辉等分离的绿脓杆菌噬菌体PL39的潜伏期为20 min,暴发期为5 min,裂解量为20。本试验分离到的绿脓杆菌噬菌体phage30潜伏期为60 min,暴发期为120 min,裂解量为156。噬菌体的裂解量与其基因组特征密切相关。噬菌体基因组中tRNAs数量越多,越有利于噬菌体蛋白的转录和翻译,进而提高噬菌体的增殖效率,缩短潜伏期的时间。噬菌体phage30潜伏期较长,暴发期长,裂解量高的原因尚需做进一步基因组测序分析。
噬菌体对温度和pH值的耐受力是衡量噬菌体稳定性的重要指标。本研究测定了噬菌体phage30对温度和pH值的敏感性,发现其对温度和pH值的耐受力都较强,这对环境中温度和pH值的不可掌控性来说是很好的应对机制。水貂的最适养殖温度在20℃～35℃,使用酸性或碱性消毒剂净化貂舍可导致环境pH值发生变化。本次分离到的噬菌体phage30在pH值5～11、温度40℃以下时其裂解活性基本保持不变,具有良好的环境适应能力。
噬菌体phage30可专性裂解绿脓杆菌,具有宿主谱宽、裂解性能高、pH值和热稳定性好的特征,有潜在的开发价值应用于绿脓杆菌病的防治。
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