为了探索抗噬菌体重组钝齿棒杆菌的应用可行性,对重组质粒pJL23-cglⅠ在钝齿棒杆菌中的稳定性以及其对宿主细胞生长代谢的影响进行了研究。实验结果表明,重组质粒在钝齿棒杆菌中具有较好的稳定性,它在钝齿棒杆菌中的存在对重组菌株的早期生长有些影响,但未影响重组菌株的谷氨酸产生量。
钝齿棒杆菌是产生谷氨酸的菌株之一,其不同衍生株在生产中得到了广泛应用。然而,由于发酵生产的规模化和连续性,生产中的菌种极易感染噬菌体,所以噬菌体污染一直是影响谷氨酸发酵生产的关键因素之一。虽然通过改进生产工艺,改善卫生条件,控制生产环节,噬菌体污染现象有所减轻,但仍时常发生[1-2]。为了解决谷氨酸发酵中的噬菌体污染问题,利用质粒携带的cglⅠ基因复合体构建了抗噬菌体钝齿棒杆菌基因工程菌,证实了cglⅠ基因复合体在钝齿棒杆菌中的抗噬菌体功能活性[3]。由于构建抗噬菌体基因工程菌的策略采用的是质粒表达外源基因,而且表达的外源基因是限制修饰(RM)系统基因复合体,所以重组质粒以及其所携带的RM在钝齿棒杆菌中的行为如何尚需实验证实。为此,本文对重组质粒在钝齿棒杆菌中的稳定性以及其对宿主细胞生长代谢的影响进行了研究。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株钝齿棒杆菌T6-13(野生型)购自中国典型培养物保藏中心,含有质粒pJL23-cglⅠ的重组钝齿棒杆菌由本实验室构建[3]。
1.1.2噬菌体5株噬菌体AS-I V3C44～ASI V3C48购自武汉病毒研究所。
1.2方法
1.2.1菌株培养钝齿棒杆菌T6-13(野生型)和重组钝齿棒杆菌培养于LB培养基(固体或液体),需要时添加50μL/mL卡那霉素。
1.2.2噬菌体裂解液的制备具体方法参见文献[4]。
1.2.3噬菌体效价测定具体方法参见文献[4]。噬菌体效价(pfu/mL)=噬菌斑数×稀释倍数×10。
1.2.4噬菌体抗性检测采用平板空斑法,成斑率(Efficiency of plaquing,EOP)计算方法：成斑率EOP=抗性菌株中噬菌体成斑数/敏感菌株中噬菌体成斑数，敏感菌株的EOP等于1。
1.2.5菌株传代[6]在LB/Km-平板上划线接种重组钝齿棒杆菌,30℃培养24 h后挑取单菌落,连续划线接种传代100次。将传代次数为1、10、20、30、……80、90、100的平板4℃保存。
1.2.6质粒分离稳定性测定[6]从不同传代次数(1、10、20、30、……80、90、100)的LB/Km-平板上,用无菌牙签分别挑取100个单菌落,分别在LB/Km-和LB/Km+平板对应位置上划短线,30℃过夜培养。计数不同代次重组菌株在LB/Km-和LB/Km+平板上的生长数,计算重组菌株在无Km选择压力条件下质粒的丢失率。质粒稳定性(%)=(LB/Km+平板上的生长数)/(LB/Km-平板上的生长数)×100%。
1.2.7质粒结构稳定性测定[6]从不同传代次数(原代、20、40、60、80、100)的LB/Km-平板上,用无菌牙签分别挑取菌落接种于LB液体培养基中,30℃过夜培养后,采用噬菌体抗性实验检测重组菌株质粒的结构稳定性。
1.2.8生长曲线分析与测定
以野生菌株作对照,测定重组菌株的生长曲线,实验重复3次,实验数据为3次实验的平均值。
1.2.9谷氨酸测定
重组菌株与野生菌株(对照)分别摇瓶发酵培养48 h,从20 h起开始取样,每隔4 h取样1次,取样时间分别设为20、24、28、32、36、40、44、48 h。采用大肠埃希菌L-谷氨酸脱羧酶解法使谷氨酸分解成CO2气体,用微量呼吸检压仪定量测定产生的CO2量,根据反应方程式计算出谷氨酸含量。实验重复3次,实验数据为3次实验的平均值。