产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)又称魏氏梭菌，兼性厌氧，为可产生芽孢的革兰阳性大杆菌，广泛分布于自然界中，是一种重要的人兽共患的条件致病菌；根据其产生的致死性毒素α、β、ε、ι毒素可将其分为A、B、C、D和E共5个毒素型。其中C型产气荚膜梭菌主要产生α和β毒素，可以引发人和禽类的坏死性肠炎、初生小牛和羔羊等反刍动物的肠毒血症、羊猝疽和仔猪红痢等多种严重疾病，对养殖业的发展产生较大的危害。据报道，产气荚膜梭菌可引起牦牛猝死综合征，主要的临床特征有牛舌脱垂、肛门外翻，病理剖检可见肺败血症、肠淤血和肠出血等症状。本试验通过对牦牛源产气荚膜梭菌生物特性进行研究，为牦牛源产气荚膜梭菌后续研究和防治等方面提供一定的参考。
1材料与方法
1.1菌株由西藏农牧学院预防兽医实验室从青海玉树地区牦牛粪样中分离保存的1株牦牛源产气荚膜梭菌，命名为qinghai-12。
1.2主要试剂和仪器
梭菌增菌液体培养基、7%羊血琼脂培养基基础，均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；无菌脱纤维绵羊血，购自北京索莱宝科技有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；最低抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)试纸，购自意大利Liofilchem公司；Trans 2K DNA Marker、核酸染料GelStain(10 000×)，均购自北京全式金生物技术有限公司。
PCR仪由Applied Biosystems公司生产；电泳仪、凝胶成像系统，均由美国Bio-Rad生产；高速离心机由德国Eppendorf生产；恒温恒湿培养箱由上海博讯实业有限公司生产；UV-1800PC型紫外可见分光光度计由上海美谱达仪器有限公司生产。
1.3菌株复苏培养与观察
将冻存于-80℃的牦牛源产气荚膜梭菌缓慢梯度升温解冻，三区划线法接种于无菌血琼脂平板，41℃恒温厌氧培养18～24 h。随后将单菌落接种至梭菌增菌液体培养基中，41℃恒温厌氧增菌培养16～18 h。革兰染色后用光学显微镜观察。
1.4生化鉴定
根据《伯杰细菌鉴定手册》，利用8种(葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、吲哚、乳糖、脂酶、卵磷脂酶、酪蛋白)细菌微量生化管鉴定产气荚膜梭菌的基本生化特性。根据陆承平推荐方法，取对数生长期的梭菌增菌液体培养基1 mL接种于适量无菌石蕊牛奶液体培养基，在45～47℃水浴2 h后，每隔1 h观察有无“汹涌发酵”现象，此特性为鉴定产气荚膜梭菌最为突出的生化特性。
1.5 PCR鉴定
1.5.1 16S rRNA PCR扩增按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取牦牛源产气荚膜梭菌全基因组DNA，-20℃冷冻保存备用。合成细菌通用16S rRNA引物，F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。16S rRNA PCR反应体系(50μL)：上、下游引物各1μL，2×TaqMix酶25μL，模板2μL，去离子水21μL；PCR反应程序：94℃预变性5 min;94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30个循环；72℃终延伸10 min，扩增条带大小为1 456 bp。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，委托擎科生物科技有限公司进行测序并上传至NCBI进行序列比对。
1.5.2多重PCR分型
合成产气荚膜梭菌分型引物(表1)。多重分型PCR体系(50μL)：上、下游引物(共4对)各1μL，2×TaqMix酶25μL，模板2μL，去离子水15μL；PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环；72℃终延伸5 min。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。
表1 PCR引物信息
1.6生长曲线测定
振荡比浊法(Dλ法)，将1.3中制备好的增菌液按体积分数1%接种于300 mL梭菌增菌液体培养基，振荡混匀后均分至15支试管作为试验组，同时分装15支无菌梭菌增菌液试管作为空白对照组，石蜡液封，置于41℃恒温培养箱中持续培养。每隔2 h取出1支试验组试管和1支空白对照组试管，以空白对照组进行调零，利用UV-1800PC型紫外可见分光光度计测定培养液OD600 nm值，每个时间点重复测量3次，取平均值，连续测量24 h。以OD600 nm值为纵坐标、培养时间为横坐标，利用Microsoft Excel 2019软件绘制出牦牛源产气荚膜梭菌的生长曲线。
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