2.5数据分析
(1)当哈维氏弧菌PBVH3311密度为103、104、105cfu/mL时(低密度弧菌)，拟合多元二次回归方程，拟合结果为:f(x，y)=9.09-0.3339x+0.02325y+0.00267x2-0.0002273xy+0.0002477y2[f(x，y)为抑菌圈直径(mm)，x为哈维氏弧菌PBVH3311密度(×103cfu/mL)，y为假交替单胞菌WCPW15003密度(×103cfu/mL)]。
当哈维氏弧菌PBVH3311密度为103、104、105cfu/mL时，若要实现100%拮抗效果，即r2=1(方程实际r2=0.9866)，此时f(x，y)=5.98×(1+0.0134)=6.06。因此，当哈维氏弧菌PBVH3311为103～105cfu/mL时，实现100%拮抗作用的方程应为：6.06=9.09-0.3339x+0.02325y+0.00267x2-0.0002273xy+0.0002477y2。
(2)当哈维氏弧菌PBVH3311密度为106、107、108cfu/mL时(高密度弧菌)，拟合多元二次回归方程，拟合结果为：f(x，y)=8.395-0.1682x+0.1161y+0.00106x2-0.00000675xy-0.0001026y2[f(x，y)为抑菌圈直径(mm)，x为哈维氏弧菌PBVH3311密度(×106cfu/mL)，y为假交替单胞菌WCPW15003密度(×106cfu/mL)]。
当哈维氏弧菌PBVH3311密度为106、107和108cfu/mL时，若要实现100%拮抗效果，即r2=1(方程实际r2=0.9544)，此时f(x，y)=5.98×(1+0.0456)=6.25。因此，当哈维氏弧菌PBVH3311为106～108cfu/mL时，实现100%拮抗作用的方程应为：6.25=8.395-0.1682x+0.1161y+0.00106x2-0.00000675xy-0.0001026y2。
3讨论
3.1拮抗菌WCPW15003及其培养基优化
哈维氏弧菌是南海近岸海洋环境中的优势菌种之一，也是华南地区海水养殖动物最常见的细菌性病原，常引发对虾发光病、对虾早期偷死综合征、石斑鱼烂身病等多种严重疾病。
革兰氏阳性菌被广泛应用于水产养殖业中，其中应用较为普遍的主要是乳酸菌和一些芽孢杆菌等。Zokaeifar等报道，将两株芽孢杆菌以108cfu/mL密度添加到饲料中，投喂8周龄凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)时，能够促进其生长及提高消化酶活力，且对哈维氏弧菌有明显抑菌活性。虽然革兰氏阴性菌在水产养殖中的应用相对较少，但有些假交替单胞菌属菌种等也是公认的益生菌。Fjellheim等报道，假交替单胞菌对大西洋鳕(Gadusmorhua)生长环境中的鳗弧菌(V.anguillarum)具有拮抗作用；Kesarcodi-Watson等报道了假交替单胞菌可保护贝类幼苗免受灿烂弧菌(V.splendidus)的侵染；其他的研究结果也表明，假交替单胞菌对哈维氏弧菌、副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus)等多种病原体有显著拮抗作用。这与本研究结果基本一致，即假交替单胞菌WCPW15003对哈维氏弧菌PBVH3311具有明显的拮抗作用。
在大多数养殖系统中，只有当弧菌密度超过104cfu/mL时，才易暴发养殖动物弧菌病；同时，通过回归方程可得知，假交替单胞菌WCPW15003密度应大于或等于养殖水体中弧菌密度，才会表现出明显的拮抗效果。因此，提高菌液中菌体密度是实现假交替单胞菌WCPW15003应用的必要前提。尽管2216E是绝大多数海洋细菌的培养基，但由于营养成分含量相对单一，不适宜假交替单胞菌WCPW15003的高密度培养。笔者通过对2216E培养基的优化，可使假交替单胞菌WCPW15003密度由2.31×108cfu/mL升至3.36×109cfu/mL，可基本满足假交替单胞菌WCPW15003规模化培养和在小水体应用的要求，为今后建立该拮抗菌的连续发酵培养和生产应用奠定了重要基础。
3.2拮抗菌WCPW15003对哈维氏弧菌病原拮抗机制
在基于培养皿的拮抗试验中，当病原菌哈维氏弧菌PBVH3311密度为103～105cfu/mL时，抑菌圈为清晰的全透明圈；当病原菌哈维氏弧菌PBVH3311密度大于106cfu/mL时，抑菌圈为两个同心圆，全透明圈在内，半透明圈在外。据此推测，当病原菌哈维氏弧菌PBVH3311密度较低时，拮抗菌假交替单胞菌WCPW15003通过识别弧菌并分泌胞外产物启动了第一套具有杀菌作用的拮抗机制，实现了低密度的拮抗菌假交替单胞菌WCPW15003的拮抗作用，拟合方程为：6.06=9.09-0.3339x+0.02325y+0.00267x2-0.0002273xy+0.0002477y2；当病原菌哈维氏弧菌PBVH3311密度较高时，拮抗菌假交替单胞菌WCPW15003除启动上述第一套拮抗机制外，还同时启动了具有抑菌作用的第二套拮抗机制，且该机制分泌的胞外产物在琼脂中的扩散速度大于第一套拮抗机制分泌的胞外产物，因此，产生半透明抑菌圈大于全透明圈的现象，此时的拟合方程为：6.25=8.395-0.1682x+0.1161y+0.00106x2-0.00000675xy-0.0001026y2。这一结果为后续开展该拮抗菌作用机制的研究奠定了重要基础。同时表明，该拮抗菌既可杀灭贫营养海水中的少量弧菌，又可抑制富营养海水中出现高密度的弧菌，还可保持富营养水体中剩余少量弧菌(承担养殖水体的物质循环作用)，从而有利于成功构建基于细菌的“活水”的养殖系统。也就是说，该拮抗菌今后不仅可用于养殖前期的海水消毒，还可用于养殖水体中弧菌密度控制，防止因高密度弧菌引发海水养殖弧菌病的暴发，且不会导致水体因完全缺少细菌而成为“死水”。
总之，本研究不仅确定了假交替单胞菌WCP15003的生长特性及其对哈维氏弧菌PBVH3311存在显著的拮抗效果，还根据不同弧菌密度率先确定了该拮抗菌对弧菌的多元二次回归方程，可根据养殖水体中弧菌密度，确定拮抗菌的准确使用量，这为假交替单胞菌WCPW15003在生产中精准施用技术开发夯实了理论基础。