2.6同源性分析
GenBank中公布的其他产气荚膜梭菌参考株序列与该菌株序列构建的系统进化发育树见图5，该菌株与北京人源(GenBank登录号：KP944154.1)、安多牦牛源(GenBank登录号：MN960262.1)、美国猪源(GenBank登录号：JQ607422.1)、华东兔源(GenBank登录号：KX986316.1)产气荚膜梭菌具有较近的亲缘性；与中国野猪源(GenBank登录号：KX094441.1)产气荚膜梭菌具有较远的亲缘性。
图5牦牛源C型产气荚膜梭菌16S rRNA遗传进化树分析
2.7 MIC测定MIC
测定结果见表4，牦牛源C型产气荚膜梭菌对头孢噻肟、氨苄西林、四环素、青霉素表现为敏感，对红霉素表现为中度敏感，对庆大霉素、复方新诺明、多黏菌素B表现不敏感。
表4牦牛源C型产气荚膜梭菌MIC测量结果
3讨论
生化试验是利用生物化学的方法测定微生物的代谢产物、代谢方式和条件进而鉴别细菌的试验。本试验中所用牦牛源产气荚膜梭菌qinghai-12的生化鉴定结果与张瑾瑜鉴定结果相同，均符合产气荚膜梭菌生化特征。
生长曲线是指以微生物生长量为纵坐标，培养时间为横坐标所绘制的曲线；常用的微生物生长量的测定方法有对微生物数量、重量及群体生理指标的测定。本试验选用数量测定中的比浊法，该方法可连续测定以获得即时数据。本试验结果显示，牦牛源C型产气荚膜梭菌qinghai-12在接种后的0～4 h内处于迟缓期，4～8 h处于对数生长期，8～24 h为生长平衡的稳定期，在测定期间内未测量到衰亡期。该结果与单雪梅等和王开功等测量的生长曲线结果不同，其原因可能是试验方案的不同和菌株宿主来源不同。另外，本试验未能测得衰亡期可能是因为生长后期死菌对菌液浑浊度产生影响，为了更准确地测定活菌的数量，应配合平板菌落计数法来对衰亡期菌落数进行校正。
由于蛋白质组成中常有酪氨酸、苯丙氨酸等芳香族氨基酸，且该类氨基酸在280 nm的紫外光处有最大吸收峰，故可根据280 nm处的吸光度大小来测量蛋白的含量。另外培养液中还存在核酸等成分，其最大吸收峰在260 nm，故可通过经验公式ρ(mg/mL)=1.45×OD280 nm-0.74×OD260 nm计算蛋白浓度，排除核酸的影响。本试验利用该方法测得牦牛源C型产气荚膜梭菌qinghai-12的最佳产毒时间是10 h，此时蛋白质含量达4.173 mg/mL，且随着时间的推移蛋白质含量持续增长。该结果与单雪梅等测量的D型产气荚膜梭菌的最佳产毒时间为10 h基本一致,与王开功等研究的A型产气荚膜梭菌所产毒素的最佳时间8 h有所差异，可能同样是与产气荚膜梭菌的宿主和毒素型有关。
MIC是测量抗菌药物的抗菌活性大小的指标之一，指在体外培养细菌18～24 h后能抑制培养基内病原菌生长的最低药物浓度，可以直观地了解病原菌的耐药性。本试验对头孢噻肟、氨苄西林、四环素、青霉素、红霉素、庆大霉素、多黏菌素B、复方新诺明8种常见抗菌药进行MIC测定，结果显示：牦牛源C型产气荚膜梭菌qinghai-12对头孢噻肟、氨苄西林、四环素、青霉素表现为敏感，对红霉素表现为中度敏感，对庆大霉素、复方新诺明、多黏菌素B表现不敏感。依据牦牛源C型产气荚膜梭菌qinghai-12来源地为青海，分析该地区可能存在庆大霉素、复方新诺明和多黏菌素B的滥用情况，推荐该地区疑似该菌感染动物优先选用头孢噻肟、氨苄西林、四环素、青霉素类药物，对红霉素的使用需慎重，必要时交叉用药，避免耐药性的产生。
综上所述，本试验复苏菌株为牦牛源C型产气荚膜梭菌，其生长特性符合梭菌生长规律，在梭菌增菌培养基中培养10 h达到最佳产毒时间，且对庆大霉素、复方新诺明和多黏菌素B耐药，对今后牦牛源产气荚膜梭菌后续研究及防治等方面具有一定的指导意义。
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