图2、Rif对一类新型超敏突变体的杀菌作用。a，rpoB突变体对Rif的敏感性和抗性图谱。b，a中数据的火山图。终止密码子为灰色。c，超敏突变体中Rif的MIC（P=1.2×10−4，从左到右为2.1×10−3）。d，用80μg ml-1 Rif处理1小时后恢复1小时后，来自野生型（WT）和rpoB T525D RNAP在高度转录基因转录起始位点（TSS）周围ChIP-seq信号的荟萃分析。e，80μg ml-1 Rif处理1小时后超敏突变体的接种效率（n=6;P=5.7×10−4、1.8×10−4）。f，用80μg ml-1 Rif处理1小时后，通过TUNEL染色测量超敏突变体的DNA损伤。TUNEL阳性细胞是在超过99%的未处理细胞中检测到的超过信号的细胞百分比（n=4;P=1.3×10−2、4.7×10−3）。g，80μg ml-1 Rif处理1小时后recA或recBCD敲除菌株中超敏突变体的接种效率（n=4，P=5.3×10-2,7.3×10-3,4.2×10-5,5.7×10-5）。h，用80μg ml-1 Rif处理1小时后，使用SLR-qPCR测量的启动子和基因体上每10千克碱基（kb）的DSB数（P=2.4×10-3、1.7×10-5、1.2×10-4、3.7×10-3、2.4×10-5、4.2×10-5）。i，超敏突变体在含有复制蛋白dnaC的温度敏感等位基因的PC2背景中的接种效率（P=1.8×10-3、7.6×10-5）。通过将细胞移至42°C 1.5小时，然后用80μg ml-1 Rif处理30分钟来阻断复制。
图3、利福平结合位点突变体的生长特性及与平均位置特性的进化保守性比较。a,在25°C下生长的5-氟尿嘧啶敏感突变体的生长曲线。b,按5-氟尿嘧啶敏感性分层的rpoB突变体在25°C和42°C下的生长曲线。c,在25°C下生长的野生型细胞添加亚抑制浓度的双环霉素的生长曲线。除非另有说明，生长曲线代表n=3个生物学独立实验的平均值，误差条表示95%置信区间。
图4、使用Bioscreen全自动生长曲线分析仪对利福平超敏感突变体（hypersensitive mutants）在80µg/mL利福平处理1小时后的恢复情况进行了生长曲线分析。测量了这些突变体在经过利福平处理后的生长恢复情况，以评估其对药物的敏感性。
图5、rpoB 515Y突变体与野生型细胞在添加0、0.1或1µg/mL胸腺嘧啶（thymidine）条件下的生长曲线。数值代表2个生物学重复的平均值。
总结
本研究是关于抗生素结合位点的高分辨率研究，特别是针对利福平（Rifampicin，Rif）与大肠杆菌（Escherichia coli）RNA聚合酶（RNAP）结合位点的详细遗传学分析。研究团队通过多路复用基因组工程技术，生成并表征了涵盖大肠杆菌RNA聚合酶整个利福平结合位点的760个单氨基酸突变体。这些突变体覆盖了rpoB基因的510-537和563-572位置，这些位置与利福平的结合有关。
研究者使用MAGE技术结合测序，不受正向选择和低突变率的限制，能够以极高的效率和特异性引入和监测细菌染色体上感兴趣区域的突变。通过这种方法，研究者生成了涵盖利福平结合位点每个位置所有可能替代的RNAP突变体集合，并提供了利福平结合相互作用的详细遗传图谱。
Bioscreen C全自动生长曲线分析仪用于监测不同突变体在利福平（Rifampicin）处理下的生长恢复情况。通过设置不同的时间点和处理条件，研究者能够详细观察突变体在药物处理后的生长延迟和恢复情况。Bioscreen C全自动生长曲线分析仪在本研究中提供了高通量、自动化和精确的生长曲线监测功能，极大地提高了实验效率和数据的可靠性，为研究利福平结合位点的突变体提供了重要的技术支持。本研究成果提供了对利福平结合位点的深入理解，揭示了RNAP的突变如何影响抗生素的结合和细菌的生理反应，为开发新的抗生素和理解细菌耐药性提供了重要的科学依据。
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