2.3健康易感猪筛选
用竞争ELISA方法和试管凝集方法同时检测30份猪血清中的猪丹毒抗体，将血清抗体PI值≤10.0%的猪判定为抗体阴性猪。结果（表2）显示，28头猪PI值均≤10.0%且试管凝集试验结果均为阴性，另外2头猪PI值分别为12.4和11.0，且试管凝集试验结果均为可疑。
表2猪血清抗体检测结果
2.4 CVCC43005株对猪最小致死剂量测定
结果（表3）显示，以3.5×1010CFU活菌静脉注射56～63日龄健康易感猪，2只试验猪在4 d内全部死亡，病死猪表现为精神沉郁、喜卧、不愿走动、厌食、颈部出现暗红色丘疹（图2）。说明CVCC43005株对猪最小致死剂量为3.5×1010CFU/头。
表3 CVCC43005株对猪最小致死剂量测定
图2发病猪颈部出现暗红色丘疹
2.5不同冻干代次CVCC43005株菌种毒力检定
1986、1996、2006、2015年4个冻干代次的CVCC43005株菌种按照最小致死剂量攻击猪，均可使猪全部死亡，毒力检定结果（表4）均符合要求。根据不同冻干代次CVCC43005株菌种毒力检定结果，CVCC43005株菌种毒力检定标准为取56～63日龄健康易感猪2头，经静脉注射菌液5.0 mL/头（活菌浓度不高于7.0×109CFU/mL），观察4 d，应全部死亡；取18～22 g小白鼠5只，经皮下注射菌液0.2 mL/只（活菌浓度不高于50 CFU/mL），观察7 d，应全部死亡。
表4不同冻干代次CVCC43005株菌种毒力检定结果
2.6不同冻干代次CVCC43005株菌种免疫原性检定
4个冻干代次的菌株制备成灭活抗原后，分别按灭活抗原0.1 mL及灭活抗原40%氢氧化铝胶生理盐水4倍稀释液0.2 mL免疫小鼠。结果（表5）显示，攻击1 000 MLD强毒菌液免疫组小鼠全部健活，对照组小鼠全部死亡，攻击1 MLD CVCC43006强毒菌液对照组小鼠全部死亡，攻击1 MLD CVCC43008强毒菌液对照组小鼠死亡4只。说明符合毒力检定标准的菌种，其免疫原性检定亦符合要求。
表5不同冻干代次菌株对小鼠的免疫原性单位：只
3讨论
《规程》对猪丹毒丝菌C43-5的毒力检定标准为“以肉肝胃消化汤培养24 h的菌液1～5 mL（每1 mL不少于活菌30亿），静脉注射断奶后1～3个月体质量20 kg以上的健康易感猪2头，应于4 d内死亡；5～10个活菌注射18～22 g小白鼠5只，均应于7 d内死亡”。现标准中主要存在两个问题：一是原标准中对猪的毒力标准仅规定了攻毒菌数的下限“每1 mL不少于活菌30亿”，没有规定上限，检定过程中可以不断增加攻毒菌数，直至猪死亡，相当于菌株没有毒力标准；二是原标准动物日龄过于宽泛，跨度3个月，猪的体质量有较大差别，对菌株的抵抗力也大不相同。为解决上述问题，本研究对猪丹毒丝菌C43-5株在肉肝胃消化汤中的生长规律进行了分析，缩小了检验动物日龄范围，测定了菌株对规定日龄范围猪的最小致死剂量，并对1986、1996、2006、2015年4个冻干代次的菌种进行了毒力和免疫原性测定。
通过分析猪丹毒丝菌C43-5株在肉肝胃消化汤中的生长曲线，选用培养16 h的菌液，初步探索出了更为合理的菌种毒力检定标准：选择56～63日龄健康易感猪2头，经静脉注射菌液5.0 mL/头（活菌数不高于7.0×109CFU/mL），观察4 d，应全部死亡；取18～22 g小白鼠5只，经皮下注射菌液0.2 mL/只（活菌数不高于50 CFU/mL），观察7 d，应全部死亡。同时，本研究对4个冻干代次菌种进行了毒力和免疫原性测定，发现4个代次的菌种毒力和免疫原性均符合规定。目前，猪丹毒菌种每隔10年需要进行1次制备和检定，包括复壮、冻干、真空度测定、纯粹检验、剩余水分测定、培养特性、生化特性、毒力、免疫原性等步骤，费时费力。而本研究结果显示，保存36、26、16年菌种的毒力、免疫原性均可达到菌种的检定标准，这为进一步延长菌种的保存时间提供了有力的数据支撑。
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