摘要：目的：优化肝靶向肽~抗肿瘤肽（CSP-MDA-7/IL-24）在大肠杆菌中诱导表达的相关条件。方法：通过考察CSP-MDA-7/IL-24重组菌生长曲线，选择合适的诱导时机，通过SDS-PAGE检测CSP-MDA-7/IL-24蛋白的表达量，单因素分析诱导时间、培养基pH值、诱导温度和诱导剂IPTG浓度，在此基础上各选取5个水平进行正交实验，摸索最佳诱导表达条件。结果：培养基pH7.0、IPTG浓度0.12 mmol/L、培养温度42℃、诱导表达4h为重组蛋白的最佳表达条件。结论：为进一步制备重组蛋白CSP-MDA-7/IL-24及评价其生物活性奠定了基础。
肝靶向肽CSP I-plus是从疟原虫环子孢子蛋白（circumsprozoite protein，CSP）中筛选得到的能够特异识别并黏附在肝细胞表面的多肽序列。肝靶向肽能与肝细胞表面受体硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycans，HSPGs）特异性结合，将具有药物活性的物质富集于肝脏部位，发挥其生物学功能。黑色素瘤分化相关基因7（melanoma differentiation-associated gene-7，MDA-7）是Fisher等于1995年发现的具有细胞因子样特性的肿瘤抑制基因，其编码的蛋白具有广谱抗肿瘤活性，有强大的“肿瘤特异性旁观者效应”，可对周围甚至远处转移的肿瘤细胞产生凋亡诱导效应，对控制肿瘤复发具有重要的临床意义，但对正常细胞无任何毒性。后来发现MDA-7与白细胞介素10（IL-10）细胞因子家族基因具有同源性和亲缘关系，属于IL-10家族，因此，2001年被重新命名为白细胞介素24（IL-24）。研究表明，MDA-7/IL-24在肝癌组织中的表达明显低于癌旁组织，其表达水平与肿瘤大小、病理分级和血清甲胎蛋白（AFP）呈明显的负相关，且随着肝癌恶性程度的增加表达水平减少或缺失。
基于肝靶向和抗肿瘤的双重作用，本实验室利用基因工程技术构建了肝靶向肽-抗肿瘤肽（CSP-MDA-7/IL-24）融合基因，期望用于肝癌术后治疗，减少术后复发率和提高生存率。如何获得大量重组蛋白CSP-MDA-7/IL-24以满足其开发应用和研究须进一步探索。我们对诱导时间、培养基pH值、诱导温度和诱导剂IPTG浓度各选取5个水平进行正交试验，对重组蛋白进行条件优化，为重组蛋白CSP-MDA-7/IL-24的规模化生产和活性评价奠定了基础。
1材料与方法
1.1材料
重组大肠杆菌BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24由广东省生物活性药物研究重点实验室保存；大肠杆菌表达载体pET21b及大肠杆菌BL21由本实验室保存。丙烯酰胺、N，N′-亚甲基双丙烯酰胺、TEMED（BioRad公司）；酵母提取物、胰蛋白胨（Oxoid公司）；异丙基-β-D-硫代半糖（IPTG）（Sigma公司）；氨苄青霉素（Amp）（Amresco公司）；蛋白预染marker（Fermentas公司）。
1.2重组大肠杆菌BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24的构建
将CSP-MDA-7/IL-24融合基因的PCR产物纯化后，分别用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切重组克隆载体CSP-MDA-7/IL-24和质粒表达载体pET21b，用T4DNA连接酶将克隆载体双酶切得到的小片段与质粒pET21b连接构建重组表达载体pET21b-CSP-MDA-7/IL-24，经鉴定为阳性后转化大肠杆菌DH5α感受态，转化菌种涂于含Amp的LB固体培养基上，37℃恒温箱培养16～18 h，获得重组大肠杆菌BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24。
1.3生长曲线测定
接菌环取一环重组菌株BL21/pET21b-CSPMDA-7/IL-24甘油种子划在LB平板上，37℃过夜培养后挑取单菌落接种到LB液体培养基中，37℃、180 r/min培养过夜，按体积比1∶100接入LB培养基中扩大培养，此时开始计时，分别在0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、7、8和9 h各取1 mL菌液测定D600nm值，以时间为横坐标、D600nm值为纵坐标，绘制表达菌株BL21/pET21b-CSPMDA-7/IL-24的生长曲线，以研究其生长规律，确定最佳诱导时机。
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