细菌计数方法是微生物学研究的基础技术，主要分为直接计数法和间接培养计数法。直接计数法主要有显微镜观察法(包括光学显微镜技术、荧光显微镜技术等)和比浊计数法等；间接培养计数法主要有平板菌落计数法(包括传统平板计数法、微菌落技术等)和最大或然数计数法(Most probable number，MPN法，也称为稀释培养法)等(王婷婷等,2008)。传统的直接计数法不能区分细菌的死活，且灵敏度低、线性范围狭窄，间接培养计数法虽然能确定活菌数量，但工作量大，难以对大批量样品进行同时操作。例如，食品安全国家标准中的菌群计数法采用MPN法和平板计数法(GB 4789.3-2010)，这2种方法都需要培养24～48 h，且工作量大、检测线性范围窄，难以进行快速、大批量的检测工作，MPN法的精确性还存在疑问；为了简化检测程序、缩短检测时间，国内外学者进行了大量的快速检测方法的研究，提出了电阻抗检测法、Sim PlateTM全平皿计数法、微菌落技术、最大或然数-聚合酶链式反应计数法(MPN-PCR法)、流式细胞仪测定法等检测方法，取得了一定的成果，但也存在不同的缺陷和不足。例如，流式细胞仪测定法虽然灵敏度、简便性都有了较大的提升，但由于其成本昂贵，且不能区分细菌的死活，在实际应用中受到了很大的制约。
MTT是3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，能穿过细胞膜被活细胞线粒体中的琥铂酸脱氢酶还原，形成蓝紫色不溶于水的甲瓒(Formazan)(Mosmann,1983)，死细胞酶活性丧失而没有颜色反应。用有机溶剂溶解甲瓒后(边兴艳,1998)，测定溶液的吸光度(OD值)而确定活细胞数(Gerlieret al,1986)。该法快速、经济、操作相对简便、重复性较好，近年来被广泛应用到大肠杆菌(Escherichia coli)(王栩等,2002)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)(黄立坤等,2008)、伴放线菌嗜血菌(Haemophilus actinomycetemcomitans)(王忠朝等,2010)和酵母菌(龚加路等,2016)等的活菌计数中。
三磷酸腺苷(ATP)是所有生命活动的能量载体(Veltenet al,2007)，活细菌中ATP含量会维持在一定范围，细菌死亡后ATP会在短时间内被细胞内酶所分解(Holm-Hansenet al,1966)，样品中ATP含量即可间接反映活细菌数量。ATP生物发光法(Milleret al,1992;Selanet al,1992;Nyrén,1994;McElroyet al,1949)是荧光素酶在Mg2+条件下催化荧光素与ATP反应形成荧光素-AMP的复合物，与O2结合时发光，发光强度与ATP浓度呈线性关系，从而检测活菌的数量(Moyeret al,1983;Grönrooset al,1983)。ATP生物发光法操作简便，能快速得到结果，与传统的平板计数法相比，不仅能区分细菌的死活，而且还能检测出不可培养的微生物(Hammeset al,2010)。
借鉴实时定量PCR的扩增曲线原理，利用微生物类似于PCR扩增的指数生长曲线(Brewster,2003)，建立了高通量生长曲线法，该法与传统的MPN法完全不同，是根据细菌生长达到特定浊度的时间进行活菌的计数，在微孔板的微量培养体积上，设置多个平行，以高通量的方式对微生物的生长进行实时监测，达到类似实时定量PCR那样在极宽的线性范围进行微生物的准确计数的效果。在上述背景下，本研究对MTT比色法、ATP生物发光法和高通量生长曲线法进行了比较。
各初始浓度菌液的生长曲线
结果：
平板计数作为活菌计数的最基本方法，通常能应用于大多数需要进行活菌计数的场合，但在一些研究不同培养条件，例如液体发酵(高戈等,2017)或固体发酵(孙静等,2017)等；理化因素，例如消毒剂或紫外线等处理；药物制剂，例如中草药或抑菌剂等；这些对特定细菌生长或存活的影响效果时，需要大量的活菌计数工作，而平板计数方法由于工作量大，材料消耗大，在用到这些大量研究对象时效率很低，且不确定度高(凌云等,2010)，因此，需要高效可靠的活菌计数方法。工作效率较高的细菌计数法可采用酶标板的高通量OD值测定，但该方法并不能区分样本中的活菌和死菌，而且如果样本中存在大量带颜色的或悬浮物等干扰光吸收的物质时(孙静等,2017)，就难以进行直接的OD值测定。因此，需要其他的活菌计数方法以弥补在特定应用中的不足。
MTT比色法操作相对简单，能满足高通量操作的需求，适用于较高浓度的活菌数检测，但其检测的线性范围只有2个数量级的跨度。当活菌数较低时，MTT的反应产物过低，从而在OD555 nm值太低而超出检测的线性范围，不适用于检测浓度太低或太高的细菌，由于高通量分析实验的场合常常会有细菌数量大大偏离MTT检测范围的情况发生，这种方法实际上在高通量活菌计数的应用中受到了较大局限，与之前报道的MTT比色法在大肠杆菌活菌计数研究的结论相符合(汪志荣等,2011)。对7.8×106～2.5×108CFU/ml线性范围内的实际样品进行检测时，所得结果与平板计数结果有一定偏离，5×106CFU/ml以下的检测结果可能会有明显偏差。此外，不同种类和不同生理状态的细菌中琥珀酸脱氢酶含量可能不同，对多种细菌混合检测的适用性可能受影响。
ATP生物发光法操作更加简便，是3种方法中检测速度最快的，准确性比MTT法高，反应速度较快，能对样品进行实时的检测反馈，线性范围能达到4个数量级的跨度。对1×104～3×108CFU/ml跨度的线性范围内的实际样品进行检测时，所得结果与平板计数结果高度吻合，对104CFU/ml以下的检测结果偏差明显增加(Chenet al,2006)。在检测较低浓度的活菌时，需要较长的检测时间来收集微弱的发光，对于大量样品的高通量检测来说，顺序检测过程会造成前后样品的时间差太大，ATP的发光会逐渐消散而对准确性造成显著影响(Selanet al,1992)。因此，该方法也不适于大样本量的高通量检测。此外，如果样品中有其他来源的ATP干扰，也会对分析的准确性产生很大的影响。
高通量生长曲线法准确性略低于ATP发光法，在本研究的手动操作条件下，检测的线性范围达7个数量级以上，对特别低或特别高的活菌数都能进行有效检测。对100～107CFU/ml跨度的线性范围内的实际样品进行检测时，所得结果与平板计数结果高度吻合，102CFU/ml以下的实际样品检测时有误差增大的可能，与Brewster(2003)的研究结果相符。高通量生长曲线法操作耗费时间较长，而且需要定时对OD值进行测定，如果完全人工手动操作，这个过程将较为辛苦。该方法不需要借助特别试剂，可以不受试剂缺乏的限制而得以应用。如果有自动生长曲线测定仪，那这样的操作将十分方便，而且能进一步增加其检测的线性范围和结果的准确性。
综合比较3种高通量方法：ATP生物发光法与高通量生长曲线法有很好的准确性，MTT比色法准确度稍差；而高通量生长曲线法有最宽的线性范围，也最适合高通量测定。