2.3优势乳酸菌的筛选与生理生化特征的鉴定
根据肉制品发酵剂的筛选标准进行产黏性试验、耐盐性试验、耐亚硝酸盐试验、耐酸性试验、葡萄糖产气试验、产H2O2试验、产H2S试验、石蕊牛奶酸凝试验、产氨试验、硝酸盐还原试验、M.R试验、V.P试验、明胶液化试验、淀粉水解试验、耐高低温试验(15℃、45℃)、运动性试验、糖醇发酵试验。
2.4菌株的生长曲线和产酸能力试验
将鉴定出的菌株分别接种于MRS液体培养基，37℃培养24 h。每4 h测1次。用可见光分光光度计于640 nm下，测定菌液的吸光度值。pH值用pH计测定。
2.5菌株的耐温性试验
不同菌株接种于其液体培养基中，分别置于15，20，25，30，35，40，45℃培养箱中培养24 h，以不接种的液体培养基为空白对照，在640 nm条件下测底OD值。
2.6 16S rDNA序列分析
2.6.1菌株DNA的提取
将筛选出菌株接种于MRS液体培养基中，37℃培养24 h，采用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株的基因组DNA，并采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
2.6.2 16S rDNA基因序列PCR扩增及序列分析
16S rDNA扩增引物:应用细菌通用引物，正向引物27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’;反向引物1942R:5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’。
PCR扩增反应体系(50μL):正向引物27F和反向引物1942R各1.5μL，dNTP(10 mmol/L)1.0μL，10×Buffer(2.5 mmol/L Mg2+)5.0μL，ddH2O 39.0μL，基因组DNA 1.0μL，Taq聚合酶(5 u/μL)1.0μL。
PCR阴性对照基因组DNA采用超纯无菌水代替。
PCR扩增反应程序:95℃预变性5 min，95℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min 30 s，经45次循环，72℃终延伸7 min。
PCR产物采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，送交北京擎科新业生物公司进行测序，测得的序列与NCBI数据库已知序列进行比对及同源性分析，应用MEGA5.0软件的邻位相连(Neighbor-joining)法分析所测序列与GenBank中模式菌株16S rDNA序列，构建系统发育树。
3结果与分析
3.1菌株形态学鉴定结果
采用MRS固体培养基，从臭鳜鱼中分离出50株菌株，观察菌落溶钙圈、革兰氏染色及过氧化氢酶试验结果，得到能产生溶钙圈、革兰氏染色呈阳性、过氧化氢酶呈阴性的疑似乳酸菌11株，具体特征见表1。
表1菌株形态学鉴定结果
根据表1的鉴定结果，所有的菌株都是呈乳白色、且菌落隆起表面光滑。分离纯化得到的所有11株疑似乳酸菌有短杆状、球状，排列方式也不尽相同。
3.2优势乳酸菌的筛选与生理生化特征的鉴定
将分离纯化得到的11株进行生理生化特征的鉴定试验，结果如表2所示。
根据表2的生理生化鉴定结果，分离所获得菌株11株菌中，只有L4、L12、L20、L36符合肉制品发酵菌株指标的要求:不产黏液、能耐受6 g/dL NaCl;在pH 4.5和250 mg/dL NaNO2条件下正常生长;发酵葡萄糖不产气;水解精氨酸不产氨;有良好的硝酸盐还原能力;M.R反应阳性;V.P反应阴性;不能发生明胶液化反应;能水解淀粉;可在15℃和45℃下生长。
将筛选得到的4株菌株进行糖醇发酵试验，具体结果见表3。
根据4株菌的表型特征和生理生化特点，检索《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)、《常见细菌鉴定手册》，可以初步判断L4为屎肠球菌(Enterococcus faecium)、L12为弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、L20为坚强肠球菌(Enterococcus durans)、L36为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)。
表2生理生化鉴定结果
表3糖醇发酵试验结果
3.3菌株生长曲线
将筛选得到的4株优良乳酸菌接种于MRS液体培养基中培养，分析生长情况，见图1。
图1乳酸菌生长曲线
如图1所示，L4在4～8 h生长速度明显高于其他菌株，在8～12 h时左右达到菌体密度最大值，之后进入稳定生长期，Herranz等人发现1株肠球菌在12 h时达到菌株密度最大值，与之相符。其他菌株在培养到8～16 h生长速度明显加快，培养到16 h后进入到稳定生长期。从图1可以看出，筛选得出的4株菌均具备较强的生长能力。
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