3.4菌株的产酸能力试验
将筛选出的4株乳酸菌接种于MRS液体培养基中培养，分析其产酸能力，见图2。
图2 24 h内乳酸菌产酸能力
如图2所示，随着培养时间的延长，4株菌株培养液的pH值均呈下降趋势，培养初期pH值随时间的变化不断下降，培养16 h后，菌株培养液的pH值下降缓慢，与菌株的生长曲线大体一致。培养至24 h时，菌株培养液pH值可达到4.40以下。结合生长曲线与产酸能力，在臭鳜鱼加工过程中，发酵初期肠球菌能迅速繁殖，产生乳酸，快速降低环境体系中pH值，为发酵与其他乳酸菌生长创造良好的条件。
3.5菌株耐温性试验
将乳酸菌菌株接种于MRS液体培养基中，在不同温度下培养，分析其耐温性，见图3。
图3乳酸菌在不同温度下的生长情况
如图3所示，4株菌在15～45℃下都能生长，在25～40℃下生长情况基本良好;45℃时肠球菌的生长情况相对于乳杆菌好。说明4株菌在25～40℃适宜生长。以目前臭鳜鱼的传统发酵工艺，发酵温度为25～30℃，筛选出的4株菌能在此范围良好生长。
3.6菌株16s rDNA分析及系统发育树的构建
3.6.1菌株基因组DNA提取
利用天根细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)提取菌株的基因组DNA，并采用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测，得到的检测电泳图只有1个条带，如图4所示，可进行16S rDNA基因序列PCR扩增。
图4菌株基因组DNA检测电泳图
3.6.2 16S rDNA基因序列PCR扩增
将菌株的基因组DNA进行16S rDNA基因序列PCR扩增，同时进行PCR阴性对照试验，扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，如图5所示，PCR阴性对照无条带，各菌株PCR产物条带单一，在1 500bp处有特异性条带，满足测序的要求。
3.6.3 16S rDNA同源性分析及系统发育树的建立
图5菌株PCR扩增凝胶电泳图
利用BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，将所测定的4株菌株的16S rDNA序列，与GenBank/EMBL/DDBJ数据库中已知细菌的16S rDNA/rRNA序列进行比较鉴定，寻找与目的基因序列同源性最高的已知分类地位的菌种。得到菌株L4的16S rDNA序列与屎肠球菌(Enterococcus faecium)的16S rDNA/rRNA序列同源性最高;菌株L12的16S rDNA序列与弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)的16S rDNA/rRNA序列同源性最高;菌株L20的16S rDNA序列与坚强肠球菌(Enterococcus durans)的16S rDNA/rRNA序列同源性最高;菌株L36的16S rDNA序列与干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的16S rDNA/rRNA序列同源性最高。
从GenBank/EMBL/DDBJ数据库中，提取已知的标准菌株的16S rRNA/DNA基因序列，利用MEGA5.0软件构建系统发育树，获得目的菌的分类地位或它的系统发育地位。如图6所示，菌株L4与屎肠球菌(Enterococcus faecium)的系统位置最接近，菌株L20与坚强肠球菌(Enterococcus durans)的系统位置最接近;菌株L12与弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)的系统位置最近;菌株L36与干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的系统位置最接近。
图6优良乳酸菌L4、L12、L20、L36的系统发育树
根据16S rDNA同源性对比结果和系统发育树，菌株L4鉴定为屎肠球菌(Enterococcus faecium)，L12鉴定为弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)，L20鉴定为坚强肠球菌(Enterococcus durans)，L36鉴定为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)。
4结论
(1)依据肉制品发酵剂的筛选标准，本文通过对臭鳜鱼中菌株的耐盐、耐酸、耐亚硝酸盐、产酸能力、生产曲线和耐温性等一系列指标的研究，筛选出4株菌都符合肉制品发酵剂的标准，具有良好的生长性能和NaCl耐受性。
(2)经过生理生化鉴定与16S rDNA序列测定分析，鉴定L4为屎肠球菌，L12为弯曲乳杆菌，L20为坚强肠球菌，L36为干酪乳杆菌。为进一步探讨乳酸菌在水产制品中的应用提供依据。
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