猪丹毒丝菌（E.rhusiopathiae）属于丹毒丝菌属，是一种两端钝圆，直或稍弯曲的细丝状菌，大小为（0.2～0.4）µm×（0.8～2.5）µm，呈革兰氏阳性，有荚膜，无鞭毛，易形成长丝状。该菌能引起猪和多种动物的急性、热性感染，临床上急性型呈败血症症状，亚急性型皮肤上出现紫色疹块，慢性型表现为关节炎和心内膜炎。猪丹毒丝菌的血清型有1a、1b、2、4、5、6、8、11、12、15、16、17、19、21和N等，不同血清型致病力不同，其中1a、1b的致病力最强，目前我国主要流行1a和2型。
猪丹毒丝菌主要感染架子猪，也可经损伤的皮肤感染人。猪丹毒病20世纪80年代以前在我国多发，随着养殖条件的改善和疫病防控水平的提高，20世纪90年代后期至21世纪初期，关于猪丹毒丝菌感染的报道较为少见。然而，2010年开始，我国部分省份零星报道发现猪丹毒病例，至2012年，猪丹毒病例显著增多，广西、广东、四川、福建、江西、湖南、安徽、上海、吉林、黑龙江等地均报道发生该病。据统计，2017—2019年，我国猪丹毒病的平均检出率为4.2%，是猪瘟的3倍、蓝耳病的48倍，猪丹毒丝菌感染率呈明显上升趋势，亟需加强防控。
免疫接种是预防和控制猪丹毒病发生和流行的重要手段。《中华人民共和国兽药典》（2020年版，以下简称《兽药典》）收录相关疫苗有猪丹毒活疫苗G4T10株、GC42株，猪瘟、猪丹毒、猪多杀性巴氏杆菌病三联活疫苗，猪丹毒灭活疫苗，猪丹毒、猪多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗等5个产品，上述疫苗产品生产用菌种均为猪丹毒丝菌C43-5株。该菌种由中国兽医药品监察所负责检定、保管和供应。现行检定依据为《中华人民共和国兽用生物制品规程》（2000年版，以下简称《规程》）。由于《规程》中未明确标明该菌的攻毒剂量上限，所以试验过程中可以无限加大攻毒剂量，故检定结果中无法描述菌株毒力，不能有效控制疫苗质量。因此，本研究开展了猪丹毒灭活疫苗生产用菌种C43-5株对猪的最小致死量研究，并对1986、1996、2006、2015年4个冻干代次的菌种进行了毒力和免疫原性测定，以期为进一步修订完善毒力检定标准，延长菌种保存期提供依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株
生产用猪丹毒丝菌CVCC43005株（2型），检验用猪丹毒丝菌CVCC43008株（1型）、CVCC43006株（2型），均由中国兽医药品监察所提供。
1.1.2主要试剂
TSA培养基，购自BD公司；马丁汤，购自北京中海动物保健科技公司；马血清，购自Gibco公司；肉肝胃消化汤、绵羊裂解血细胞全血、猪丹毒活疫苗活菌计数用参考品（8.5×108～12.5×108CFU/头份）、猪丹毒抗体竞争ELISA检测试剂盒，均由中国兽医药品监察所提供。
1.1.3实验动物
ICR小鼠（SPF级、16～18 g、雌性），购自北京维通利华实验动物技术有限公司；猪（普通级、56～63日龄、雌雄各半），购自隆安实验动物中心。
1.2方法
1.2.1 TSA培养基配制及质量控制
称取40 g TSA溶于940 mL注射用水，121℃灭菌15 min备用。取猪丹毒活疫苗活菌计数用参考品3瓶，按照《兽药典》进行活菌计数。培养平板为含10%马血清、0.2%绵羊裂解血细胞全血的TSA平板，培养条件为33℃，培养时间为42 h。
1.2.2 CVCC43005株培养及制备工艺确定
将CVCC43005株冻干菌种用1.0 mL肉肝胃消化汤复溶后，取0.5 mL接种于含5%马血清、0.2%绵羊裂解血细胞全血、0.4%葡萄糖的10.0 mL肉肝胃消化汤中，33℃静置培养20 h；取新鲜菌液划线接种于含10%马血清、0.2%绵羊裂解血细胞全血的TSA平板，33℃培养42 h，作为一级种子；从一级种子上选取3个典型菌落接种于含5%马血清、0.2%绵羊裂解血细胞全血、0.4%葡萄糖的10.0 mL肉肝胃消化汤（置于100 mL盐水瓶）中，33℃120 r/min培养12 h，作为二级种子；取2.0 mL二级种子接种于含5%马血清、0.2%绵羊裂解血细胞全血、0.4%葡萄糖的100.0 mL肉肝胃消化汤（置于250 mL三角瓶）中，33℃120 r/min培养，从培养1 h开始，每间隔1 h取1次样，进行活菌计数，直至培养24 h后结束。