浓香型白酒是中国四大基础酒之一，典型特征就是采用泥窖固态发酵[1-2]。浓香型白酒经泥窖发酵、蒸馏、勾调而成，窖泥中微生物丰富是浓香型白酒酯类丰富的主要原因之一，己酸乙酯是酒体中主要的呈香物质，所以浓香型白酒以己酸乙酯为主体香[3]。乳酸乙酯也是浓香型白酒中最重要的呈香物质之一，浓香型白酒中含有适量的乳酸乙酯可以提高白酒的品质，过高或过低可能会导致浓香型白酒主体香味不突出和酒体粗糙[4]。
在白酒的酿造过程中，环境十分复杂，产乳菌产生过量的乳酸，导致酒体中乳酸含量过高，和乙醇发生酯化反应生成大量的乳酸乙酯，过量的乳酸乙酯是影响白酒风味和品质的重要指标[5-6]。乳酸乙酯性质稳定，一旦形成很难分解，所以只能减少乳酸乙酯的前体物质“乳酸”来达到降低乳酸乙酯的目的[7-8]。
本研究通过对老窖泥的筛选分离，筛选出能够利用乳酸的微生物。通过镜检、分子生物学方法对其进行鉴定，然后进行乙醇的耐受性、pH的耐受性、葡萄糖存在条件下对乳酸的消耗情况研究，以期为将该菌株应用到白酒中打下基础，为浓香型或清香型白酒提高品质提供一定的帮助。
1材料与方法
1.1材料、试剂及仪器
1.1.1材料
窖泥：湖北省某酒厂优质窖泥。
1.1.2培养基
乳酸钠培养基：1%乳酸钠，1%(NH4)2SO4，0.2%酵母膏，0.5%（NH4)2HPO4，配固体需要加入2%的琼脂。115℃灭菌20 min。
乳酸钠葡萄糖培养基：1%乳酸钠，0.5%葡萄糖，1%(NH4)2SO4，0.2%酵母膏，0.5%（NH4)2HPO4。配固体需要加入2%的琼脂，115℃灭菌20 min。
1.2试验方法
1.2.1初筛
取10 g窖泥放入90 mL灭过菌的生理盐水中，振荡15 min，用纱布过滤，得到的过滤液进行梯度稀释（10-2、10-3、10-4、10-5），取每个稀释梯度液，使用涂布棒涂布于乳酸钠固体培养皿中，34℃培养24 h，挑选能在乳酸钠培养基上生长的微生物单菌落。
1.2.2复筛
将挑取的单菌落涂布于乳酸钠固体培养皿中，每个挑取的单菌落至少划线3次以上，得到的单菌落可以基本确定为能够利用乳酸的微生物，挑选单菌落进行镜检，观察其形态特征[9]。
1.2.3优良乳酸利用菌的筛选
将复筛得到的6株乳酸利用菌，接入乳酸钠培养液中活化24 h，按照5%的接种量，将6株菌株分为2组，分别接种到乳酸钠液体培养基中。1组在恒温摇床中进行有氧培养，另一组在恒温培养箱中进行深层液体厌氧培养，每个组的菌株都在34℃下培养3 d，每个菌株做3个平行试验。
取每个菌株第1 d和最后1 d培养液各2 mL，使用高效液相色谱测样品中的乳酸含量，通过2次乳酸差值计算出各菌株的乳酸利用量，选择对乳酸利用较好的菌株进行进一步试验。
1.2.4优良乳酸利用菌发酵性能的测试
1.2.4.1葡萄糖对乳酸利用菌的影响
白酒酿造过程中含有一定的葡萄糖，因此在葡萄糖存在的条件下利用乳酸是菌株作为乳酸利用菌的重要指标[10]。
将筛选得到的优良乳酸利用菌，接种到乳酸钠培养液中活化24 h，按照5%的接种量，将菌株活化培养液接种到乳酸钠葡萄糖液体培养基中，34℃培养条件下培养3 d，1组进行有氧培养，1组进行深层厌氧培养，每个菌株各做3个平行。取第1 d和第3 d发酵液各2 mL，使用高效液相色谱测发酵液乳酸含量和通过生物传感分析仪测发酵液葡萄糖含量。
1.2.4.2优良乳酸利用菌pH值耐受性的测试
将乳酸利用较好的两株菌株进行活化，活化好的菌液分别按照5%的接种量，接种在pH值为5.5、6.5、7.5、8.5、9.5的乳酸钠培养液中。在34℃恒温摇床中进行有氧培养3 d，每个梯度做3个平行试验，从1 d开始取样，每天取样2 mL，通过测定培养液的OD600值，判断菌株生长状态。
1.2.4.3优良乳酸利用菌乙醇耐受性的测试
将优良乳酸利用菌活化好的培养液，按照5%的接种量，分别接种在含有不同浓度梯度乙醇（0%、1%、2%、3%、4%、5%）的乳酸钠培养液中[11]。在34℃恒温摇床中进行有氧培养3 d，每个梯度做3个平行试验，从1 d开始取样，每天取样2 mL，测培养液OD600的值。
1.2.5发酵液分析方法
1.2.5.1乳酸的测定方法
乳酸的测定采用高效液相色谱法[12]。样品处理：取100μL发酵液加入到900μL超纯水中稀释10倍，用0.45μm有机滤膜过滤，将滤液装入进样瓶中进样。
1.2.5.2葡萄糖含量的测定方法
葡萄糖含量[13]：使用生物传感仪进行测定。用葡萄糖标准液进行定标，将稀释10倍后的样品，用微量进样器取25μL注入生物传感仪测定。
1.2.5.3样品菌液浓度的测定方法
使用分光光度计，用光密度（OD600值）表示样品菌液浓度。
1.2.6优良耗乳菌的菌种鉴定
（1）试剂盒提取基因组DNA；（2）PCR扩增16S rDNA：96℃预变性5 min，96℃变性20 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，进行35个循环，72℃保温10 min。PCR产物进行1.0%的琼脂糖凝胶检测，观察条带性状；（3）将PCR产物送到华大基因测序。将测序结果进行NCBI-BLAST比对[14]。
老窖泥筛选分离的6株乳酸利用菌培养、发酵性能、生长范围（一）
老窖泥筛选分离的6株乳酸利用菌培养、发酵性能、生长范围（二）