实验采用龙陵黄山羊耳缘组织块贴壁培养法首次对龙陵黄山羊成纤维细胞进行体外培养，通过原代培养、传代培养、冷冻保存建立了龙陵黄山羊耳缘成纤维细胞系；并对其细胞形态、细胞活率、细胞核型等生物学特性进行了分析。结果表明：细胞倍增时间48 h，生长曲线为“S”型；染色体中正常二倍体染色体2n=60所占比例为91.68%。
龙陵黄山羊为云南省的地方优良品种，因其被毛黄色且产于龙陵县而得名。该品种具有适应性强、耐粗饲的特点，并以肉质细嫩、味美多汁、膻味小而著称。龙陵县地处中缅边境。龙陵黄山羊是在特殊的地理环境下，经过长期的自然选择和人工选育形成的。该羊于1987年被列为云南省山羊保种品种之一，目前保种主要采取原产地活体保种的方式，保种方式单一、保种成本高，难以承担繁重的保种任务。而体细胞建系和冷冻保存技术是解决云南省地方家畜品种遗传资源保护的有力手段，它不但可以长时间保存优良家畜品种遗传资源，而且结合其他生物技术，如体细胞克隆或转基因技术，可以加快新品种培育速度，从而提高云南省家畜种质资源创新利用的技术水平。本研究针对此背景，以龙陵黄山羊这一省级保护动物的细胞为研究对象，利用动物细胞培养技术，从染色体水平、形态学水平进行了研究，并对遗传种质资源进行了保存。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验材料龙陵黄山羊耳样采自云南省保山市龙陵县乌木山良种繁育场，试验用耳样来源于1月龄龙陵黄山羊耳缘组织。
1.1.2主要试剂、仪器高糖DMEM、胎牛血清（FBS）由Gibco公司生产。青链霉素溶液和胰蛋白酶溶液购自Bioind公司；一次性塑料培养皿为Nunclon公司生产。
主要仪器设备：倒置相差显微镜（Olympus，Nikon）；CO2培养箱（Thermo）；透射电镜（JEM-1011）；实体显微（Olympus）；细胞计数仪；程序降温盒；液氮罐等。
1.2方法
1.2.1耳缘组织成纤维细胞原代培养选择健康的龙陵黄山羊耳缘组织刮净毛，用碘伏消毒后再用75%的酒精擦拭。用灭过菌的耳号钳取耳缘组织样本，75%酒精浸泡2min，再用生理盐水+1%青链霉素溶液冲洗3次，然后放入高糖DMEM+1%青链霉素溶液中，并放入4℃泡沫箱，24 h内带回实验室进行培养。在超净工作台上用柳叶刀刮去皮肤表面污物。用含1%青链霉素的PBS溶液冲洗4次，再用手术剪剪成碎块，放入直径50mm的培养皿中，每皿7～8块，缓慢加入少量培养液。培养液：高糖DMEM+10%FBS+1%青链霉素。最后放入培养箱（37℃，5%CO2，饱和湿度）中培养。每天在倒置相差显微镜下观察、照相、记录细胞迁移和增殖情况。
1.2.2成纤维细胞传代
培养当成纤维细胞长至培养皿（瓶）底壁85%左右时，用PBS清洗3次，再用枪头吸净培养皿（瓶）里的PBS，加入0.125%胰酶（含0.01%EDTA）37℃消化5min左右后，在倒置相差显微镜下观察，当细胞开始变圆并有少量细胞脱落时，加高糖DMEM+15%FBS液终止消化，吹打细胞使其完全脱落，以1∶2或1∶3比例进行传代培养。倒置相差显微镜下观察传代细胞生长增殖状况，并拍照。传代培养液与原代培养液相同。
1.2.3成纤维细胞冷冻与复苏细胞冷冻：
0.125%胰酶（含0.01%EDTA）消化收集细胞，1 500 r/min离心5min，弃上清，用高糖DMEM+30%FBS+10%二甲基亚砜（DMSO）冻存液调整细胞浓度为1×107～3×107/mL，充分混匀，分装在冻存管中。冻存管上标明细胞名称、冻存管编号、性别和冻存日期。然后放入程序降温盒中，于-80℃冰箱过夜，次日投入液氮罐中长期保存。
细胞复苏：从液氮中取出冻存管，迅速投入42℃水浴锅中，不停摇动使其受热均匀达1 min，转移至离心管中离心，弃上清，加入细胞培养液重悬细胞，移至培养皿（瓶）中，在（37℃，5%CO2，饱和湿度）的培养箱中培养。倒置相差显微镜下观察复苏细胞生长状况，并拍照。
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