随着海水养殖规模的扩大和养殖环境的持续恶化，养殖动物细菌性疾病呈暴发性流行，已成为制约全球海水养殖业可持续健康发展的重要因素，严重影响着海水养殖业的发展。其中弧菌病是海水动物养殖中危害最为严重的病害之一。哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)具有毒性大、耐药性强、可侵染多种宿主的特点，已成为华南地区海水养殖最严重的细菌性病原之一。为防治疾病，多采用抗生素和化学药品控制弧菌病，结果不仅使养殖水体的正常菌群遭到破坏，还导致病原菌株的耐药性增强，严重污染近岸海域生态环境。因此，建立哈维氏弧菌病原的生态防控技术是当前确保我国华南地区海水养殖产业健康发展的必由之路。
利用微生物间的拮抗作用开展生物防治，是防控水产细菌性病原的重要有效途径。目前应用于水产养殖上的拮抗菌制剂主要有两大类：(1)单一制剂，如荧光假单胞菌(Pseudomonnasfluorescens)、中间气单胞菌(Aerommasmedia)、芽孢杆菌(Bacillus)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、乳酸菌、乳酸杆菌(Lactobacillus)、溶藻胶弧菌(V.alginolyticus)、光合细菌、蛭弧菌(Bdellovibriobacteriovorus)等；(2)复合益生菌制剂，如美军方、复合型活性生物净水剂等，这类益生菌主要由硝化和反硝化假单胞菌、乳酸杆菌、酵母菌、双歧杆菌、反硝化细菌、枯草杆菌等菌株组成。
近年来，自海南文昌地区中分离出的假交替单胞菌(Pseudoalteromonassp.)WCPW15003对哈维氏弧菌的拮抗作用最为明显，但该菌在2216E培养基中的最高培养密度仅108cfu/mL，且针对不同密度弧菌病原的具体使用密度也未确定，难以实现规模化培养和应用。笔者将以2216E培养基为基础，通过额外补充一定含量的碳源和氮源，优化假交替单胞菌WCPW15003的培养基组分；同时，确定不同密度弧菌病原所需要的最低拮抗菌密度，其结果将为今后开发防治热带海水养殖哈维氏弧菌病原的益生菌制剂及其施用技术奠定良好基础。
1材料与方法
1.1菌株
假交替单胞菌WCPW15003，分离自海南文昌水产养殖系统底泥样品(深80 cm)；哈维氏弧菌PBVH3311分离自海南临高某对虾养殖基地。以上2株菌种保存于本实验室。
1.2方法
1.2.1菌种活化
取保藏于-80℃冰箱中的哈维氏弧菌PBVH3311和假交替单胞菌WCPW15003，接种于2216E液体培养基中，30℃，180 r/min振荡培养24 h。
1.2.2活菌计数标准曲线测定
取10 mL活化后的假交替单胞菌WCPW15003菌悬液或哈维氏弧菌PBVH3311菌悬液，4000 r/min离心5 min，移除上清液，重悬于PBS溶液；进行二倍倍比稀释，稀释5个密度梯度，分别测菌悬液吸光值。将各稀释梯度吸光值与其对应稀释倍数进行线性相关分析，要求r2>0.98。采用平板计数法检测相应菌液中的活菌密度(cfu/mL)。根据菌悬液吸光值和活菌密度，绘制其活菌计数标准曲线。
1.2.3生长曲线测定
使用Bioscreen C全自动生长曲线分析仪测定假交替单胞菌WCPW15003和哈维氏弧菌PBVH3311的生长曲线。操作如下：加350μL的2216E液体培养基至蜂窝板，分别接种活化的假交替单胞菌WCPW15003菌悬液和哈维氏弧菌PBVH3311菌悬液各50μL，充分吸打混匀，于30℃下，180 r/min振荡培养72 h，每小时检测1次吸光值，检测波长为600 nm。设置3个平行组。
1.2.4培养基优化
以2216E培养基为基础培养基，其组分为：胰蛋白胨(5 g/L)、酵母提取物(1 g/L)、磷酸铁(0.01 g/L)，通过补加一定量的牛肉膏或(和)红糖，组成假交替单胞菌培养基A、B、C(试验组)(表1)。每组设置3个平行。
表1假交替单胞菌培养基
注：“+”表示添加，“-”表示不添加.
接种1%(体积比)活化后的假交替单胞菌WCPW15003菌悬液(密度为3×108cfu/mL)，振荡培养(30℃，180 r/min)至对数生长晚期。采用标准曲线计数法，确定各组菌悬液密度。采用SPSS 18.0软件对组间数据进行单因素方差分析和Duncan多重比较，统计值用平均值±标准差表示，以P<0.05表示差异显著，以P<0.01表示差异极显著。
1.2.5拮抗试验
将活化的哈维氏弧菌PBVH3311菌悬液稀释后加入2216E半固体培养基(pH 7.6、盐度30)中，制作成病原菌平板。病原菌平板密度设置为101～108cfu/mL共8个10倍倍比稀释密度。采用琼脂扩散法测定101～109cfu/mL共9个10倍倍比稀释的假交替单胞菌WCPW15003菌悬液的拮抗作用效果，打孔直径为5.98 mm。培养温度为30℃，正置培养24 h，用数显游标卡尺测量抑菌圈直径(精确到mm)。设置3个平行组。采用Matlab软件对数据进行回归分析，拟合多元二次回归方程。
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