鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)属于疱疹病毒,能感染鸭、鹅等雁形目禽类,可引起产蛋下降及高死亡率,已报道了多株DEV的全基因组序列,DEV基因组大,长度约158—162 kb。与疫苗株相比,DEV疫苗检验用参考强毒株基因组UL区5′端连续插入3 513 bp(2 716—6 228位核苷酸)导致UL56基因移框突变。目前关于DEV基因功能、致病机理等报道较少。本研究通过构建了重组病毒,以研究连续3 513 bp插入对DEV生物特性的影响;以提取的DEV基因组DNA为模板,分别扩增UL56基因上下游两端同源臂UL56-u、UL56-d。将两同源臂片段克隆到pMD18T-Simple载体,获得重组质粒pT-UL56ud。将重组质粒pT-UL56ud用I酶切,电泳回收去磷酸化后,将红色荧光蛋白(RFP)表达盒插入到pT-UL56ud中,获得重组质粒pT-UL56-RFP。


DEV接种鸭胚成纤维细胞(DEF)(MOI=0.1),吸附1—2 h后,按Lipofectamine 2000说明书转染高纯质粒pT-UL56-RFP,通过同源重组的方法,以红色荧光蛋白(RFP)基因为报告基因,构建了缺失DEV UL56下游3 513 bp的重组病毒DEV△3513及其回复株DEVΔ3513(R)。将重组病毒及其亲本病毒分别接种25 cm2的细胞瓶中(MOI=0.01),测量其病毒含量,绘制一步生长曲线;将重组病毒及其亲本病毒分别作适当稀释,接种已长成单层DEF,加入M199营养琼脂糖覆盖,培养5—7 d,随机选取20个蚀斑,测量蚀斑面积;将重组病毒、回复株及其亲本病毒分别以105.0TCID50肌肉注射6周龄易感麻鸭进行致病性试验,观察10 d,每天记录发病死亡情况。试验结束后剖检所有存活鸭。对全部动物取肝脏组织,固定于4%多聚甲醛溶液,按常规程序制备病理切片并进行H.E染色;将重组病毒及鸭瘟商品化活疫苗株(CVCC AV1222)分别以103.0TCID50肌肉注射6周龄易感麻鸭进行免疫原性试验,在免疫后14 d,腿部肌肉注射接种DEV强毒(CVCC AV1221),每只103.0MLD。


观察10 d,每天记录发病死亡情况。通过同源重组的方法,获得携带RFP的重组病毒DEV△3513-RFP、缺失DEV UL56下游3 513 bp的重组病毒DEV△3513及其回复株DEVΔ3513(R)。重组病毒DEVΔ3513、DEVΔ3513(R)及其亲本毒均在接种DEF后72 h,病毒含量达到峰值(106.2-6.5TCID50/0.1 mL),病毒含量无明显差异;均能在DEF细胞中形成清晰蚀斑,大小无明显差异;DEVΔ3513对6周龄易感麻鸭毒力明显减弱,未出现任何临床症状和死亡;DEVΔ3513以103.0TCID50/只免疫麻鸭,能抵抗DEV强毒株的攻击;成功构建了缺失UL56基因下游3 513 bp的重组病毒,首次证实UL56基因下游3 513 bp对DEV在细胞中的复制是非必需的;缺失UL56基因下游3 513 bp后病毒仍保留良好的免疫原性;UL56基因下游3 513 bp是DEV的一个毒力决定因子。


【研究意义】鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV),又称鸭瘟病毒,属于疱疹病毒科,能引起鸭、鹅等雁形目禽类发生急性、热性、败血性的传染病。该病也称为鸭瘟,发病率和死亡率很高,对水禽养殖业危害很大。


本研究根据DEV强弱株基因组差异,拟分析DEV毒力相关基因,解析DEV致病机制,探索外源基因插入位点、活载体疫苗开发的可行性。

【前人研究进展】目前已完成多株DEV全基因组测序。DEV疫苗检验用参考强毒株(CVCC AV1221)于1962年从南京一鸭场分离,是我国较早分离的一个强毒,毒力稳定,是我国官方评价鸭瘟疫苗免疫效果的参考强毒,其基因组全长为162 131 bp。与参考强毒株基因组相比,DEV疫苗株UL区5′端连续缺失了3 513 bp(2 716—6 228位核苷酸)导致UL56基因移框突变;德国分离DEV 2085株基因组在2 561位核苷酸后连续缺失1 170 bp,该区域是否与DEV毒力相关,尚未见报道。

【本研究切入点】本研究以红色荧光蛋白(RFP)为报告基因,构建缺失UL56基因下游3 513 bp的重组病毒,比较缺失前后病毒在细胞中的生长特性以及对易感鸭的致病性、免疫原性。

【拟解决的关键问题】本研究旨在分析UL56基因下游3 513 bp对DEV生物特性的影响,为揭示DEV UL56基因下游3 513 bp功能、DEV活载体疫苗研究奠定基础。



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