摘要：从黄河三角洲盐碱地土壤分离到一株耐高盐菌株NM-1.对该菌株生理生化性质、耐盐性以及系统分类位置进行了分析。结果表明：菌株NM-1为长杆状，革兰氏阴性，菌落黄色，呈圆形，湿润、光滑。能利用葡萄糖、乳糖和蔗糖，不能利用淀粉和明胶。生长pH范围为8.0——10.0,最高耐盐浓度（NaCl）为30%,为中度嗜盐微生物，最适生长的Na2CO3浓度为0.25 M.16S rDNA序列分析表明：该菌株与Halomonas variabilis（JN645866）以及Halomonas variabilis（AY204638）序列的相似性均为98%,结合其形态、生理生化性质，认定该菌株属于耐盐单胞菌属，暂命名为Halomonas sp.NM-1（AB917466）。
我国北方如黄河三角洲以及内蒙古等地广泛分布着大面积的盐碱地，在这些高盐环境中生长的微生物群体由于长期适应环境，逐渐形成了极为特殊的耐盐机制，具有很高的研究和利用价值。
目前，已发现的中度嗜盐菌多为盐单胞菌属（Halomonas）的革兰氏阴性菌、好气杆菌。该属是1980年Vreeland等鉴定出伸长盐单胞菌（Halomonaselongate）时首次提出的。也有其他科的好氧或兼性厌氧菌，包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、产甲烷菌和严格厌氧细菌。耐盐单胞菌是一类能在绝对盐度（NaCl）为0%——32%条件下生长的耐盐细菌。目前报道的盐单胞菌属细菌都生长在高盐环境，如盐场和盐湖、盐水湿地、盐渍土、海水、海生生物、深海热液喷口、盐碱地。
作者从黄河三角洲盐碱地土壤中分离一株高耐盐菌，对其形态、生理生化性质、耐盐能力以及16S rDNA基因序列进行了解析，以期为开发和利用耐盐菌种资源奠定一定的理论基础。
1材料与方法
1.1试样及培养基
土壤样品采集于黄河三角洲盐碱地，共选取11个采样点，将各点表层（3——30 cm）土壤采集后混匀，立即装入灭菌的密封袋中，土样带回实验室后立即对菌进行富集和分离。剩余样品储存于4℃冰箱中待用。
富集培养基成分：（NH4）2SO41 g,K2HPO47 g,KH2PO43 g,MgSO4·7H2O 0.1 g,葡萄糖10 g,蒸馏水1000 mL.分离培养基成分：酵母膏10 g,蛋白胨7.5 g,柠檬酸钠3.0 g,KCl 2.0 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,FeSO4·7H2O 0.036 g,NaCl 20.0 g,Na2CO310.0 g,蒸馏水1000 mL,pH用盐酸或氢氧化钠调节。富集培养基及分离培养基均在121℃灭菌20 min后使用，制备固体平板培养基时加入15 g·L-1琼脂，制备半固体培养基时加入2 g·L-1琼脂。
1.2耐盐细菌的富集、分离和筛选
称量5 g土样加入盛有45 mL无菌水的烧杯中，搅拌，使土壤溶解，静置20 min,取土壤浸出液10 mL加入盛有200 mL已灭菌的富集培养基中，恒温振荡培养6 d（130 r·min-1,30℃），取3 mL上述培养液转接到新鲜的富集培养基中，重复培养3次，培养条件同上，得到耐盐碱细菌富集液。
1.3生理生化性质测定
对上述纯化得到的单菌落用耐盐菌富集液体培养基进行富集培养，得到富集培养液，对其生理生化性质进行测定，测定指标包括革兰氏染色、MR实验、V.P实验、明胶水解实验、淀粉水解实验、糖发酵实验、H2O2酶测定，操作方法见参考文献.
1.4不同pH对耐盐碱菌生长的影响
所用培养基为富集培养基。用NaOH调整培养基pH分别为8、9、10、11和12.分装150 mL于250 mL三角瓶中，121℃灭菌20 min,冷却，然后接种1.5 mL富集培养液（109cfu·mL-1）。培养条件为恒温振荡培养（130 r·min-1,30℃），每隔24 h定期取培养液，测定其吸光度（OD），波长采用560 nm,平行测定3个重复。
1.5不同NaCl浓度对菌生长的影响
向富集培养基中加入NaCl,分别配制成含10%、20%和30%的NaCl溶液，调整pH为9.0,接种、培养以及吸光度测定均同1.4,平行测定3个重复。
1.6不同Na2CO3浓度对菌株生长的影响
向富集培养基中加入不同质量的Na2CO3,使Na2CO3浓度分别为0、0.2、0.25、0.3 M,121℃灭菌20 min,接种富集培养液并定期测定菌液吸光度OD560,培养条件及测定方法同1.4,平行做3个重复。
1.7耐盐菌DNA的提取、PCR反应及系统树的创建
1.7.1细菌DNA提取
采用UNIQ-10柱式细菌基因组抽提试剂盒（上海生物工程有限公司）对菌株进行DNA提取，提取步骤按照试剂盒说明书进行。
1.7.2引物
采用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，引物序列：7F:5‘-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’;1540R:5‘-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’.
1.7.3PCR反应条件
1.7.4系统发育树的创建及分类学位置的确定
利用DDBJ（DNA Data Bank of Japan,http://www.ddbj.nig.ac.jp/）数据库，把分离菌株测得的16S rDNA序列进行序列比较，与相似度高的16S rDNA序列创建系统发育树，所用软件为CustalX2.1和Mega5（Molecular Evolutionary Genetics Analysis），系统进化距离矩阵根据Kimura模型估算，创建方法为邻接法（Neighbor-Joining）。