1材料与方法
1.1试验时间、地点
试验于2015年6月至2017年7月在中国兽医药品监察所完成。
1.2试验材料
1.2.1毒株和细胞DEV参考强毒株（CVCCAV1221）由中国兽医微生物菌种保藏管理中心保存；SPF鸭胚购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。
1.2.2试验动物6周龄易感麻鸭（中和抗体＜1﹕4）购自北京昌平某鸭场。
1.2.3质粒和菌株含有红色荧光蛋白RFP基因的载体pT-RFP由中国兽医药品监察所病毒制品检测室构建保存；pMD18T-Simple载体购自大连TaKaRa公司，DH5α受体菌购自天根生化科技（北京）有限公司。
1.2.4主要试剂Ex Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、T4 DNA聚合酶购自大连TaKaRa公司；胶回收试剂盒等均购自天根生化科技（北京）有限公司；胎牛血清、M199培养液购自Hyclone公司；OPTI-MEM培养液购自Gibco公司；lipofectamine2000购自Invitrogen公司；无内毒素高纯质粒提取试剂盒Endo-free Plasmid Mini Kit II购自Omega公司。
表1目的基因的扩增引物及鉴定引物
1.2.5引物试验所用PCR引物见表1，由上海Invitrogen生物公司合成。
1.3试验方法
1.3.1基因组DNA的提取参照文献进行。
1.3.2重组质粒的构建重组质粒pT-UL56-RFP构建策略见图1。以提取的DEV基因组DNA为模板，分别扩增UL56基因上下游两端同源臂UL56-u、UL56-d。将两同源臂片段克隆到pMD18T-Simple载体，获得重组质粒pT-UL56ud。将重组质粒pT-UL56ud用I酶切，电泳回收去磷酸化后，与用I酶切的pT-RFP连接，将RFP表达盒插入到pT-UL56ud中，获得重组质粒pT-UL56-RFP。按Endo-free plasmid mini kit II说明书提取高纯度质粒备用。
a：DEV基因组示意图，包括UL,IRS,US和TRS区域；b：PCR扩增UL56基因的上下游片段UL56-u，UL56-d；c：DEVΔ3513-RFP的构建，将RFP基因表达盒插入到DEV UL56基因组；d:应用融合PCR从DEV亲本毒中扩增UL56-ud。PCR产物与DEVΔ3513-RFP进行同源重组，获得重组病毒DEVΔ3513；e:应用PCR从DEV亲本毒中扩增UL56u-3 513 bp-UL56d。PCR产物与DEVΔ3513-RFP进行同源重组，获得重组病毒DEVΔ3513(R)
1.3.3重组病毒DEVΔ3513-RFP的构建DEV接种DEF（MOI=0.1），吸附1—2 h后，按Lipofectamine 2000说明书转染高纯质粒pT-UL56-RFP。按文献进行蚀斑纯化。
1.3.4重组病毒DEVΔ3513的构建以DEV基因组DNA为模板，用引物UL56-uF、Overlap-R以及Overlap-F、UL56-dR进行融合PCR。纯化的PCR产物与重组病毒DEVΔ3513-RFP共转染。
1.3.5重组病毒DEVΔ3513(R)的构建以DEV基因组DNA为模板，用引物UL56-uF、UL56-dR进行PCR扩增。纯化的PCR产物与重组病毒DEVΔ3513-RFP共转染。
1.3.6一步生长曲线将重组病毒及其亲本病毒分别接种25cm2的细胞瓶中（moi=0.01），接种后每隔12h取出1瓶接毒细胞，测量其病毒含量，绘制一步生长曲线。
1.3.7蚀斑大小分析将重组病毒及其亲本病毒分别作适当稀释，接种已长成单层DEF，加入M199营养琼脂糖覆盖，培养5—7 d。随机选取20个蚀斑，应用CellSens v1.6软件（Olympus Company，Japan）对蚀斑面积进行测量。
1.3.8致病性试验将20只6周龄易感麻鸭，随机分成4组，每组5只。第1组肌肉注射DEVΔ3513，每只105.0TCID50；第2组肌肉注射DEVΔ3513(R)，每只105.0TCID50；第3组肌肉注射DEV亲本毒，每只105.0TCID50；第4组注射生理盐水，作对照。每组单独隔离饲养，观察10 d，每天记录发病死亡情况。试验结束后剖检所有存活鸭。对全部动物取肝脏组织，固定于4%多聚甲醛溶液，按常规程序制备病理切片并进行H.E.染色。
1.3.9免疫原性测定将15只6周龄易感麻鸭，随机分成3组，每组5只。第1组肌肉注射DEVΔ3513，每只103.0TCID50；第2组肌肉注射鸭瘟活疫苗种毒（CVCC AV1222），每只103.0TCID50；第3组注射生理盐水，作对照。每组单独隔离饲养。在免疫后14天，腿部肌肉注射接种DEV强毒（CVCC AV1221），每只103.0MLD。观察10 d，每天记录发病死亡情况。
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