1.2方法
1.2.1分离菌株鉴定
(1)阴沟肠杆菌2025分离培养。福建养殖场污水经过纱布过滤，接取滤液在APW培养基固体平板(按体积加入1.5%琼脂粉)上三区画线，于37℃培养箱培养12~16 h。挑取平板中菌落形态相同且数量最多的优势菌落加至APW液体培养基摇菌6 h，接取所得菌液在APW培养基固体平板上三区画线，重复该步骤直到平板上只存在形态相同的菌落。将纯化后的菌液于APW培养基(观察高盐环境生长情况)及LB培养基(观察低盐环境生长情况)固体平板(按体积加入1.5%琼脂粉)上三区画线，于37℃培养箱培养12 h，观察不同培养基平板中菌落形态。
(2)阴沟肠杆菌2025 16S rRNA鉴定。利用16S rRNA通用引物进行PCR扩增，将获得的扩增片段测序，测序工作由擎科生物科技公司完成。将所得结果在NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行比对，再利用MEGA软件(https://www.megasoftware.net)绘制系统发育树确定其菌种。
(3)阴沟肠杆菌2025药物敏感性试验。利用34种药敏片鉴定阴沟肠杆菌2025对不同抗生素的耐药性。将不同药敏片贴在涂满该菌的APW培养基固体平板上，于37℃培养箱培养12~16 h，测量每种抗生素的抑菌圈直径并与CLSI和EUCAST建立的耐药判定标准进行比对(抑菌圈直径为0时，说明该抗生素对细菌无杀灭作用)。
1.2.2噬菌体分离纯化与电镜观察
(1)阴沟肠杆菌2025噬菌体分离纯化。参考Li等的方法，取扬州某水产市场收集的污水50 mL于室温环境下8 000×g离心10 min，经0.22μmol/L滤网过滤后加入APW培养基配方(蛋白胨10 g/mL、氯化钠30 g/mL)，充分混匀后加入对数期阴沟肠杆菌2025 50μL，在37℃、220 r/min培养箱中摇菌6 h。将培养液8 000×g离心10 min，离心后使用0.22μmol/L滤网过滤，采用双层平板法检测滤液中是否存在噬菌体。
双层平板法:取200μL阴沟肠杆菌2025加至50℃半固体APW(按体积加入0.5%琼脂粉)培养基中，快速颠倒混匀倒在固体APW培养基上，待上层琼脂凝固后在双层平板上不同位置滴加5μL处理过的水样，37℃培养箱培养6~12 h，观察是否有噬菌斑生成。
挑取单个噬菌斑后置入1.5 mL离心管捣碎，加入1 mL磷酸缓冲盐(phosphate-buffered saline，PBS)缓冲液，震荡15 s，室温8 000×g离心10 min，取上清液用0.22μmol/L滤网过滤。取20μL滤液与2 mL菌液混合，于37℃、220 r/min培养箱摇菌5 h，取培养液室温8 000×g离心10 min，使用0.22μmol/L滤网过滤。将滤液梯度稀释10倍，每个梯度取100μL与100μL对数期阴沟肠杆菌2025菌液充分混合后加到50℃半固体APW(按体积加入0.5%琼脂粉)培养基中，快速颠倒混匀倒在固体APW培养基上，待上层琼脂凝固后置于37℃培养箱中培养6~12 h，挑取单个噬菌斑扩培，重复3~5次，直至在同一平板上只存在大小形态完全一致的噬菌斑即纯化完成。
(2)噬菌体的电镜观察。将效价为1010 PFU/mL的噬菌体悬浮液在碳网格(200目)上孵育10 min，用2%磷钨酸染色3 min，避光自然晾置30 min后，用透射电子显微镜HT 7800观察。
1.2.3噬菌体ZX14生物学特性鉴定
(1)最佳感染复数(MOI)测定。按照MOI为10、1、0.1、0.01、0.001的不同比例将噬菌体与对数期阴沟肠杆菌2025(1×109 CFU/mL)混合，培养2 h后测定不同MOI噬菌体效价。
(2)一步生长曲线绘制。参考黄桥栏等的方法，将噬菌体悬浮液(1×1010 PFU/mL)与对数期阴沟肠杆菌2025(1×109 CFU/mL)按MOI=1比例混合，37℃下静止孵育15 min，4℃下8 000×g离心10 min，弃掉上清液以去除未吸附在宿主菌上的噬菌体颗粒。将沉淀重悬于1 mL APW液体培养基中，重复此步骤3~4次。取100μL重悬液至10 mL新鲜APW液体培养基中震荡混匀，置于37℃、220 r/min培养箱中培养，每隔20 min取100μL培养液采用双层平板法测定效价。根据“裂解量=裂解末期噬菌体效价/裂解初期宿主菌浓度”计算噬菌体ZX14的裂解量。
1.2.4噬菌体ZX14稳定性鉴定
(1)噬菌体ZX14温度耐受性测定。取噬菌体ZX14悬浮液(7×108 PFU/mL)各1 mL置于不同温度(37℃、50℃、60℃、70℃、80℃)水浴锅中处理20 min、40 min、60 min后测定效价。
(2)噬菌体ZX14 pH稳定性测定。取4 g片状氢氧化钠溶于100 mL去离子水中，配制成1 mol/L氢氧化钠溶液，再与1 mol/L盐酸按不同比例配制成pH=2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0的缓冲液。将噬菌体ZX14(109 PFU/mL)分别与不同pH缓冲液按1∶9充分混合，于37℃静置1 h后测其效价。
(3)氯仿敏感性测定。将噬菌体溶液与氯仿溶液按体积比为0.2、0.5、1、2、3、4混合，震荡混匀15 s后静置30 min，利用双层平板法测量噬菌体效价。
1.2.5噬菌体ZX14宿主谱测定
测定菌株包括5种变形杆菌、5种发光杆菌、7种肠杆菌及4种不动杆菌。采用双层平板法检测噬菌体ZX14对不同菌株是否具有裂解性，取200μL不同菌液加入到50℃半固体APW培养基中，快速颠倒混匀倒在固体APW培养基上，待上层琼脂凝固后在双层平板上不同位置滴加5μL噬菌体悬液，37℃培养箱培养6~12 h，观察是否有噬菌斑生成。有则表明ZX14对该菌具有裂解性，标记为(+);无则表明ZX14对其没有裂解性，标记为(-)。利用双层平板法测定噬菌体ZX14对不同菌株的效价，再除以阴沟肠杆菌2025的效价以测定其成斑率(efficiency of plaquing，EOP)值，EOP≥0.5表明ZX14对该种细菌裂解效果较高，0.1≤EOP<0.5表明裂解效果中等，EOP<0.001表明噬菌体对该细菌无裂解效果，标记为(/)。
1.2.6噬菌体体外杀菌活性实验
通过测量噬菌体对一定体积中细菌数量的影响来评估噬菌体在体外的杀菌作用。将噬菌体ZX14悬浮液与阴沟肠杆菌2025菌液(108 PFU/mL)按不同MOI(MOI=0.1、0.01和0.001)混合，并在37℃、220 r/min培养箱中培养。使用微量分光光度计每30 min测定一次培养物OD600值。
1.2.7噬菌体ZX14基因组分析
利用病毒基因组提取试剂盒提取噬菌体ZX14基因组，样品送至武汉臻阅生物科技有限公司，利用华大BGI平台进行测序和全基因组序列拼接。噬菌体ZX14全基因组序列上传至GenBank，序列号为PP236086。
全基因组序列通过tRNAscan-SE(2.0.9)进行tRNA预测。在CARD数据库(http://ngdc.cncb.ac.cn/databasecommons/database/id/7106)与VFDB数据库(http://www.mgc.ac.cn/VFs/)进行耐药基因与致病菌毒力因子预测。使用RAST(https://rast.nmpdr.org/rast.cgi)对ORFs进行注释。使用蛋白质比对工具(Basic Local Alignment Search Tool Protein，BLASTp)对所有ORFs在NCBI参考序列数据库(Reference Sequence，RefSeq)中的病毒蛋白数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/labs/virus/vssi/#/)进行检索。基于BLASTp比较结果，使用OAT软件(https://www.ezbiocloud.net/tools/orthoani)对基因组全序列进行平均核苷酸相似度(average nucleotide identity，ANI)分析。将噬菌体末端酶大亚基序列在NCBI上进行BLASTp检索非冗余蛋白数据库(Non-RedundantProtein Sequence Database，NR)，选取与其相似的前18个序列在MEGA软件使用邻接法(neighbor-joining method，NJ method)构建系统发育树。
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