3讨论
作为植物病原菌分泌毒力因子的重要装置，分泌系统一直以来都是病原细菌研究的热点，其中T3SS在各型分泌系统中研究较多。革兰氏阴性动植物病原菌利用T3SS将效应蛋白注入真核宿主细胞中，跨膜T3SS装置和ATP酶有关，ATP酶可为分泌过程提供能量。hrcN基因表达产物为ATP酶，该酶在细菌内膜上形成一个与分泌器相关的环状结构，并在效应蛋白的分泌过程提供能量，对T3SS和细菌的致病性是必不可少的。hrcN基因敲除后对致病力等表型的影响还未见报道，但与HrcN蛋白具有相同功能的InvC蛋白基因敲除后，突变株较野生型菌株毒力与定殖率皆显著降低。InvC与大肠杆菌F0/F1-ATPase具有催化功能的β亚基氨基酸序列相似程度很高，invC基因突变后其蛋白水解ATP的能力丧失，突变体分析进一步鉴定出InvC参与核苷酸水解和膜结合的氨基酸序列。本研究以青枯雷尔氏菌T3SS的hrcN基因为研究对象，该基因是AAA+ATPase家族成员之一，产物为ATP酶。利用同源重组技术得到了hrcN基因部分缺失突变株，发现突变株较野生型菌株的致病力下降，病程延长，与青枯雷尔氏菌T3SS效应蛋白基因Rip56敲除后致病力测定结果相似。结果表明hrcN是青枯雷尔氏菌的致病基因之一，影响T3SS效应蛋白的分泌。
接种试验表明，hrcN基因突变株导致青枯雷尔氏菌对番茄的致病力下降，为了充分研究基因功能，进一步对其生长速率、生物被膜和运动性等基础生物学特性进行探究。Kanda等测定了烟草青枯雷尔氏菌的生长曲线结果显示，不管在贫营养培养基或者富营养培养基上，野生型菌株与hrpB基因突变株生长速率基本一致。本试验发现野生型菌株、hrcN基因突变株和回补菌株在富营养培养基上的生长速率基本一致，在贫营养培养基上，hrcN基因突变株比野生型菌株生长更快，这与Kanda等的研究结论不一致。在贫营养培养基上突变株比野生型菌株生长更快的文献还未见报道，对番茄青枯雷尔氏菌hrcN基因突变后的代谢是否产生变化尚未可知，需进一步通过组学等技术探究其原因。
病原菌通过自身的运动获得了更大的生存空间，鞭毛等器官可为其提供运动能力。通过运动性病原菌对有利或不利的环境快速做出响应，避开有害的环境，接近有利的宿主附近，扩大生存范围。运动性能够促使植物病原菌在侵染初期识别、吸附和入侵宿主植物并进行定殖和扩展，提高病原菌的致病能力，而运动性对病原菌入侵植物后的阶段不起作用。此次研究发现hrcN基因敲除后对番茄青枯雷尔氏菌的运动能力没有影响，而敲除spoT和relA基因后对青枯雷尔氏菌的运动能力影响很大。
生物被膜作为保护细菌的生物活性膜，能够形成在非有机体和有机体的表面。其主要成分为蛋白质、胞外多糖、脂质和胞外DNA等，是一种复杂的三维结构。当环境发生改变，细菌形成生物被膜可以保持水分，通过调节代谢降低营养物质的消耗，从而有助于细菌存活。细菌形成的生物被膜将自身包围，处于其中的细菌相互彼此接触，影响许多微生物的生存与定殖，比如植物病原细菌通过昆虫传播、直接侵入或从受伤部位入侵植物组织，利用生物被膜增强在植物根、茎、叶和种子等部位的定殖与生存，通过阻塞植物木质部导管和维管束组织，引起组织损伤，破坏被感染的组织，造成植物萎蔫。
玉米细菌性萎蔫病病原菌Pantoeastewartii、马铃薯软腐病病原菌Pectobacterium carotovorumbrasiliense和油菜黑腐病病原菌Xanthomonas campestris等的生物被膜能够阻塞植物木质部导管和维管束组织，引起组织损伤，破坏被感染的组织，造成植物萎蔫。研究还发现，柑橘溃疡病病原菌Xanthomonas citri的T3SShrpB缺失突变株不能在柑橘叶片表面聚集，丧失生物被膜的形成能力，革兰氏阴性菌Acidovorax citrulli的4个Ⅵ型分泌系统基因突变株在甜瓜种子上形成生物被膜和定殖的能力降低，某些分泌系统与生物被膜形成和细胞聚集有关。
本研究发现hrcN基因突变株相比于野生型菌株，生物被膜形成能力显著减弱，结合hrcN基因突变株致病力降低，说明hrcN基因敲除后，番茄青枯雷尔氏菌生物被膜形成能力降低，番茄木质部导管阻塞程度减弱，萎蔫减轻，病情指数降低。本研究为后续探究青枯菌T3SS的功能及其致病机制提供基础，研究发现青枯雷尔氏菌hrcN基因敲除后菌株毒性减弱，未来可以作为青枯病的生防菌株，具有一定的应用价值。
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