针对酒曲中的微生物进行分离纯化，得到11株细菌和2株真菌，并采用酪蛋白平板法和Arima时间法筛选出了1株产凝乳酶的细菌菌株编号为LB-51。通过形态学观察、生理生化实验和16S rDNA序列分析鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌，将该产凝乳酶菌株命名为解淀粉芽孢杆菌GSBa-1。该菌株在液体LB培养基中发酵72 h产凝乳酶的凝乳活力为（431.53±15.89）SU/mL，蛋白水解活力为（5.05±0.59）U/mL，所产凝乳酶凝乳活力高而蛋白水解活力低，凝乳酶粗酶单位酶活力为1.54×105SU/g。解淀粉芽孢杆菌GSBa-1是分离筛选自酒曲中的一株高产凝乳酶细菌，因此其来源安全，可作为工业化候选菌株进一步研究开发。
凝乳酶（EC 3.4.23.4）是干酪加工时添加于原料乳中使乳液凝固的关键性酶，其凝乳及蛋白水解活性对干酪的得率、质构和特殊风味有着非常重要的影响；传统凝乳酶的制作是用盐从牛犊皱胃中浸提出来。随着世界干酪产量逐年上升，传统凝乳酶的供应已无法满足现代干酪工业生产的需求。为此，国内外科学家们进行了大量的研究以寻找凝乳酶新的来源。微生物具有生长不受气候和地域的限制，来源广泛且发酵容易控制，生长周期短、产酶量大、经济效益高等优势，是目前最有发展潜力的酶制剂来源。目前微生物源凝乳酶的研究主要集中在真菌的固态发酵产酶方面，工业上主要采用米黑毛霉、微小毛霉和粟疫霉等真菌发酵生产凝乳酶；而细菌具有较真菌体积小、繁殖快、产物易于提取分离、适合高密度培养增殖产酶等优势，因此利用细菌工业化发酵制备凝乳酶是近年来凝乳酶研究开发的热点问题。
江米酒是我国一种传统食品，由酒曲发酵江米制作而成。而宫廷奶酪是由江米酒凝固牛乳制作而成，口感细腻，具有良好的乳胶体稳定性。其凝乳过程主要与江米酒中的凝乳酶有关；该酶是发酵剂酒曲中的微生物发酵江米代谢的产物。目前，研究者主要从酒曲中筛选得到产凝乳酶的霉菌，并进行了相关的研究。酒曲中的重要菌系——细菌，也属于酒曲中的正常菌相；但国内尚鲜有从酒曲中筛选高产凝乳酶细菌的相关报道。江米酒作为一种传统食品，采用其中筛选得到的菌株发酵生产凝乳酶，在食品卫生学上是安全的。
本研究拟从江米酒中筛选高产凝乳酶细菌，对其形态学、生理生化特征和16S rDNA序列分析进行鉴定，并对其产凝乳酶的凝乳活力及蛋白水解活力进行测定。该研究拓宽了微生物源凝乳酶产生菌的菌源，为进一步研究开发食用安全的干酪加工用细菌凝乳酶提供了理论支持。
1材料与方法
1.1材料与培养基
酒曲产自江苏苏州；长江米购于北京市永辉超市；脱脂乳粉产自澳大利亚。
LB液体培养基：酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、氯化钠10 g/L，121℃高压灭菌20 min。LB固体培养基：LB液体培养基添加15 g/L琼脂粉。yEPD培养基：酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂粉15 g/L，pH 6.0，115℃湿热灭菌20 min。PDA培养基：马铃薯浸粉15 g/L、葡萄糖3 g/L、琼脂粉15 g/L、蒸馏水1L，121℃高压灭菌20 min。酪蛋白培养基：蛋白胨0.25%、葡萄糖1%、酵母膏0.1%、干酪素1%、琼脂2%、脱脂牛乳5%，pH7.0，95℃灭菌15 min。
1.2仪器与设备
HWS 12恒温水浴加热锅上海一恒科学实验装备有限公司；HZQ-Q气浴恒温摇床哈尔滨东联电子科技有限公司；高速离心机CR21GⅢ、U-3900分光光度计日本日立有限公司；全自动凝胶成像系统美国Bio-Rad公司。
1.3方法
1.3.1江米酒的制备
按5%的酒曲添加量接种于提前蒸熟冷却好的长江米中，接着把经灭菌冷却好的去离子水按40%添加到江米中，搅拌均匀，30℃、120 r/min摇床振荡培养3 d。
1.3.2江米酒中微生物的分离纯化
采用梯度稀释法将江米酒倍比稀释，分别取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8稀释液各50µL涂布于LB、yEPD和PDA 3种固体培养基，将培养基放置于30℃恒温培养箱内培养，并于第2、3、5天挑取不同菌落进一步划线纯化，直至纯种，分别将其编号以作进一步研究。
1.3.3产凝乳酶优势菌的确定
酪蛋白法初筛产凝乳酶优势菌株：将达到纯种的菌株分别以三点法接于酪蛋白平板上，放置于30℃恒温培养箱内培养2 d，观察不同菌株产白色凝乳圈的大小和水解圈的大小。
不同培养基发酵复筛菌株：在产生凝乳圈和水解圈的菌株中，分别从平板中挑取少量菌落接种于LB、yEPD和PDA 3种不同液体培养基中，30℃、120 r/min摇床振荡培养24 h作为活化种子液，然后按3%的接种量接于已灭菌的不同培养基中，30℃、120 r/min摇床振荡培养后测定凝乳活力和蛋白水解活力。
1.3.4凝乳活力的测定
酶活力根据改进的El-Bendary等的方法测定，将脱脂乳粉溶于0.01 mol/L的CaCl2溶液配制成10%的脱脂乳溶液，室温放置30 min；于35℃中保温5 min，35℃条件下，准确量取待测酶液0.2 mL加入2 mL10%的脱脂乳溶液中，迅速混匀，开始计时，准确记录至絮状凝集颗粒出现为止。凝乳活力的定义：在40 min内凝固100 g/L的脱脂乳1 mL所要的凝乳酶量规定是一个索氏单位（Soxhelt unit，SU），按公式（1）计算：
式中：t为凝乳时间/s；n为酶液稀释倍数。
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