1.3.5蛋白水解活力的测定
蛋白水解活力测定。取2 mL 1.5%酪蛋白溶液于35℃保温5 min，加入0.5 mL预热好的待测酶液混匀后继续水浴恒温放置60 min，然后加入2 mL 8%的三氯乙酸终止反应，将沉淀过滤后测定滤液在280 nm波长处的吸光度，记为A1。制备空白样品时，先取0.5 mL待测酶液直接与8%的三氯乙酸混合，使其立刻终止反应，后加入2 mL 1.5%酪蛋白溶液，重复过滤步骤，滤液作为空白对照，测定其在280 nm波长处的吸光度，记为A2。
本实验条件下，60 min引起A280nm增加0.001所需的酶量为1个酶活力单位，按公式（2）计算：
1.3.6产凝乳酶菌株的鉴定
1.3.6.1形态学观察
将产凝乳酶优势菌在LB固体平板上划线，于30℃恒温培养箱内培养2～3 d后观察菌落生长情况及菌落形态。将菌体进行芽孢染色及革兰氏染色后于高倍显微镜下观察菌体形态。
1.3.6.2 API试剂条法对菌株鉴定
将平板中培养好的新鲜菌体用无菌生理盐水溶解，根据API 50 CHB比浊法达到菌体浓度要求，然后分别加入API 50 CHB试剂盒各孔内，37℃静置培养24 h和48 h，观察试剂盒各孔颜色的变化。
1.3.6.3菌株16S rDNA序列扩增与分析
采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA，根据上述菌株鉴定所得由杆菌科的16S rDNA序列设计引物：正向引物P1：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物P2：5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’。以菌株基因组DNA作为PCR扩增的模板，PCR体系（20µL）为：上下游引物各1µL、DNA模板1µL、超纯水7µL、TaqDNA聚合酶10µL。PCR参数为：95℃预变性3 min；95℃变性0.5 min，55℃退火0.5 min，72℃延伸2 min，30个循环；70℃末端延伸10 min，4℃保存。取5µL产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，将大小正确的目的片段送至北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司测序。将测序结果提交到GenBank中选取相关菌株的16S rDNA基因序列进行比对分析，选取相似性较高的序列，与实验菌株一起用软件MEGA 6.0构建系统发育树，进行系统发育分析。
1.3.7产凝乳酶菌株生长曲线和产酶活力曲线的的测定
1.3.7.1生长曲线的测定
从产凝乳酶菌株的平板中挑取少量菌体接种于已灭菌的液体LB培养基中，30℃、120 r/min恒温振荡培养，培养30 h，从2 h起每隔2 h测定菌体OD600nm值，实验重复3次，绘制菌株生长曲线。
1.3.7.2酶活力曲线的测定
挑取少量LB-51菌体接入液体LB培养基中，30℃、120 r/min条件下恒温振荡12 h，作为活化种子液；以3%的接种量接种于已灭菌的LB液体培养基中，装液量为体积分数40%，30℃、120 r/min条件下恒温振荡培养，分别在培养0、12、24、36、48、60、72、84、96 h时，分别按照1.3.4和1.3.5节方法测定凝乳活力和蛋白水解活力，实验重复3次，绘制菌株产酶活力曲线图。
1.3.8菌株发酵产凝乳酶及其分离提取
将活化的菌液以3%的接种量接种到已灭菌的LB液体培养基中，30℃、120 r/min条件下恒温振荡培养72 h。发酵液经8 000 r/min离心30 min以去除菌体，上清液放置于4℃冰箱内冷却2 h。向4℃的发酵液中加入预冷的无水乙醇，使混合后的乙醇体积分数为70%，迅速搅拌均匀，于4℃冰箱中静置过夜，4℃、10 000 r/min离心30 min，沉淀用0.005 mol/L的pH 5.8的磷酸盐缓冲液溶解以防止蛋白质凝聚或变性，溶解液放置在4℃冰箱中冷藏，之后于4℃条件下透析除盐并冷冻干燥成酶粉。
1.3.9冻干凝乳酶的凝乳活性评价
取0.01 g粗酶冻干粉于5 mL去离子水中，充分溶解后按照1.3.4节方法测定凝乳活力，根据公式（1）换算粗酶的单位酶活力，并与商业凝乳酶做对比。