2结果


2.1重组病毒的构建及鉴定


DEV感染DEF细胞2 h后,用Lipofectamine 2000转染高纯质粒pT-UL56-RFP。转染后约10 h,即可见转染细胞中有带有红色荧光的梭形细胞。72 h左右80%细胞出现病变,收获病毒,冻融3次,用DEF细胞分离、纯化红色蚀斑,经过5代筛选,获得纯化的重组病毒DEVΔ3513-RFP。


按照同样的方法,去除RFP获得了缺失UL56基因下游3 513 bp的重组病毒DEVΔ3513;用UL56基因下游3 513 bp替换病毒DEVΔ3513-RFP中的RFP,获得了回复突变株DEVΔ3513(R)。经测序鉴定,所构建的3个重组病毒均正确。


2.2一步生长曲线


一步生长曲线结果表明,重组病毒DEVΔ3513、DEVΔ3513(R)及其亲本毒均在接种后72 h,病毒含量达到峰值(106.2-6.5TCID50/0.1mL),随后病毒含量下降(图5)。表明UL56下游3 513 bp的缺失对DEV的复制没有明显影响,缺失后病毒滴度无显著变化。

图2重组病毒的一步生长曲线


2.3蚀斑大小分析


重组病毒及其亲本毒均能在DEF细胞中形成清晰蚀斑;亲本毒、DEV-Δ3513、DEV-Δ3513(R)蚀斑面积分别为(1.91±0.28)mm2、(1.82±0.31)mm2、(1.98±0.25)mm2,无显著差异(>0.05)(图5-9),说明UL56基因下游3 513 bp缺失不影响DEV在细胞间的传播能力。

图3重组毒及其亲本毒蚀斑面积


2.4致病性试验


DEV亲本毒、重组病毒DEV-Δ3513(R)在接种后3日麻鸭开始出现精神沉郁状;7日全部死亡,剖检肝脏表面有大量散在的白色坏死点。病理组织学观察可见:静脉和肝血窦淤血,充满大量红细胞;肝细胞内有大量脂滴呈空泡状,发生脂肪变性;部分区域出现局灶性肝细胞坏死,在坏死区域伴有炎性细胞,胞核溶解,与其他研究结果一致。而DEV-Δ3513接种鸭和对照鸭在14 d观察期内,未出现任何临床症状和死亡。病理组织学诊断可见肝脏组织结构清晰,肝细胞形态正常,未见明显病理变化。说明UL56基因下游3 513 bp缺失后毒力明显减弱。


2.5免疫原性测定


重组病毒DEVΔ3513以103.0TCID50/只、104.0TCID50/只剂量,免疫麻鸭后14 d,均能100%抵抗DEV强毒攻击(表2),表明UL56基因下游3 513 bp缺失后仍具有良好免疫原性。

图4肝脏病理切片(H.E.染色)

表2免疫后的攻毒保护效力


3讨论


本研究以红色荧光蛋白RFP为报告基因,以DEV参考强毒株为亲本毒,通过同源重组,构建了缺失UL56基因下游3 513 bp的重组病毒DEVΔ3513及其回复突变株DEVΔ3513(R)。并对其细胞生长特性、致病性和免疫原性进行研究。体外试验表明,重组病毒在细胞中的一步生长曲线、蚀斑大小与亲本毒相似,说明UL56基因下游3 513 bp缺失不影响DEV在细胞上的生长,是病毒复制非必需基因。动物试验结果表明,UL56基因下游3 513 bp缺失能显著降低DEV的毒力,是DEV的一个毒力决定因子;缺失后仍保留良好的免疫原性,能抵抗致死性强毒攻击,与现有商品化鸭瘟活疫苗免疫原性相当。

表3免疫后的攻毒保护效力


我国鸭瘟活疫苗毒株,其亲本毒于1957年从我国广东分离,然后经鸡胚连续传代60多代致弱。全基因组序列比较发现,与DEV参考强毒株相比,疫苗株基因组UL区5′端连续缺失了3 513 bp(2 716—6 228位核苷酸)导致UL56蛋白C端第215位氨基酸后移框变和UL55缺失。在α疱疹病毒中,除了牛疱疹病毒1型和5型外,均含有UL56同源物。UL56蛋白存在病毒粒子中。疱疹病毒UL56蛋白C端有一个疏水区,含跨膜区和多个PPxY基序等,为典型的跨膜锚定功能域。该功能域对维持单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus 1,HSV-1)毒力表型具有重要作用。致病性HSV-1的UL56被LacZ替代后,腹膜内注射不能引起树熊发病;弱毒HSV-1 HFEM株UL56基因被强毒HSV-1 17株的UL56替换后,能恢复其毒力表型,进一步研究表明,缺失UL56蛋白C末端疏水区(217—234位氨基酸)导致HSV-1毒力丧失。


本研究从DEV参考强毒与疫苗株基因组差异入手,分析了UL56基因下游3 513 bp对DEV参考强毒生物特性的影响,揭示了该区域对维持DEV毒力发挥了重要作用。下一步将缩小缺失范围,重点研究UL56蛋白C末端疏水区对DEV毒力的影响。


4结论


4.1重组病毒生长特性与亲本毒相似,首次证明UL56基因下游3 513 bp对DEV在细胞中的复制是非必需的。


4.2缺失UL56基因下游3 513 bp能显著降低DEV的毒力,首次证明是UL56基因下游3 513 bp是DEV的一个毒力决定因子。


4.3缺失UL56基因下游3 513 bp后仍保留良好的免疫原性。


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