摘要
本研究旨在从健康北极狐肠道中分离和鉴定具有益生菌潜能的乳酸菌，并对其体外益生功能进行评价。对分离菌株进行生理生化和16S rRNA鉴定，测定其生长曲线、产酸和耐酸曲线，测定该菌的胆盐耐受性以及在人工胃液和人工肠液中的存活率，分别采用牛津杯琼脂扩散法和纸片扩散法检测该菌的抗菌活性和抗生素敏感性。最后选取20只雌性昆明小鼠，随机分为2组(每组10只)，对照组灌胃生理盐水，试验组灌胃唾液乳杆菌(1×109 CFU/mL)，试验期7 d。结果表明:结合16S rRNA和生理生化鉴定结果将其命名为唾液乳杆菌ZJBF005，该菌在MRS培养基中生长迅速，具有较强的产酸能力;在pH 4~7培养液之间生长良好，培养液pH低于2生长受到抑制;在人工胃液、人工肠液中培养3 h后的存活率分别为40.96%和86.70%;可在0.2%的胆盐环境中生长;可抑制沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的生长;对四环素、庆大霉素、万古霉素、磷霉素、阿奇霉素、甲氧苄啶和甲硝唑等抗生素不敏感;灌胃后的小鼠体重变化正常、无死亡、剖检无病理性变化。综上所述，来自健康北极狐肠道的唾液乳杆菌ZJBF005具有良好的益生菌特性，可作为益生菌的备选菌株。
益生菌是一种活的微生物，当给予足够的剂量时，会对宿主的健康产生良好的影响。在人类中用于预防和治疗疾病、传染性和非传染性疾病，并在家禽、家畜、水产养殖中有广泛的应用。对于性能良好的益生菌来说，其在口腔溶菌酶、胃pH和肠胆汁等酸性环境中的生存能力是一个重要因素。益生菌的抑菌活性、抗炎活性和增强上皮细胞免疫屏障功能也是优异益生菌所要具备的关键因素。
北极狐为犬科动物，目前对其肠道微生物的研究较少。前期研究表明，北极狐肠道存在复杂的微生物区系，在北极狐营养物质消化利用、维护机体健康和免疫功能方面发挥重要作用。本项目组已在健康北极狐肠道中分离获得多种益生性能良好的益生菌。来自特定宿主的益生菌能更好地适应该宿主的环境。因此，本试验旨在从健康北极狐肠道中分离和鉴定具有益生菌潜能的乳酸菌，并对其体外益生功能进行评价，为其在动物营养与饲料中应用提供理论基础。
1、材料与方法
1.1试验材料
1.1.1样品采集
2021年11月20日于长白山野生生物资源重点野外科学观测试验站采集24只冬毛期健康北极狐的肠道内容物。
1.1.2菌株和细胞
唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)ZJBF 005、大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 25922、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)ATCC 14028和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)均由中国农业科学院特产研究所特种动物营养与饲养团队分离、鉴定和保存。
1.1.3试验动物
21日龄无特定病原体(SPF)级雌性昆明小鼠20只，体重(22±2)g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，动物生产许可证号:SCXK(辽)2020-0001。
1.2试验方法
1.2.1菌株的分离培养
采集北极狐空肠肠段内容物1 mL装于5 mL离心管，低温条件下运输回实验室。将离心管置于生物安全柜内操作，离心管内加入适量磷酸盐缓冲液(PBS)进行振荡混匀，吸取100μL混合液进行梯度稀释，随即取10-5、10-6、10-7稀释液100μL分别涂于MRS平板，置于恒温培养箱。挑取单菌落在MRS平板中反复平板划线以获得纯化菌株，筛选和保存革兰氏阳性菌株，对纯化后的菌株进行冻干保存。
1.2.2菌落形态及染色
取冻干菌粉于MRS液体试管中，37℃恒温培养48 h后传代，蘸取少量菌液采用平板划线法培养单菌落，观察菌落颜色和形态，采用革兰氏染色法进行染色后，显微镜观察。
1.2.3 16S rRNA基因序列测定
将待测菌株培养24 h后提取该细菌基因组DNA。以细菌基因组DNA作为目的基因进行PCR扩增。PCR反应体系见表1。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，菌株的保守序列约为1 500 bp，将片段长度正确的PCR产物送至天一辉远生物科技有限公司进行测序。从GenBank中获取的基因序列在NCBI网站进行BLAST比对，通过MEGA进行比对建树。
表1 PCR反应体系
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