1.3.2细菌16S rDNA鉴定
采用DNA提取试剂盒提取腐败菌的DNA，以通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-TACCTTGTTACGACTT-3’）对目标细菌的V 3区进行P C R扩增。5 0μL P C R扩增体系：2×Taq Master Mix 25μL，DNA模板1μL，引物（10μmol/L）各1.5μL，ddH2O 21μL。PCR扩增程序：95℃预变性10 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环；最后72℃再延伸10 min。
PCR扩增产物通过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，将条带清晰的扩增产物送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，通过www.NCBI.nlm.gov./blast网站进行序列同源性比对。
1.3.3 PCR-DGGE分析
1.3.3.1微生物总基因组DNA提取
样品处理同1.3.1节，采用细菌DNA提取试剂盒提取4℃贮藏6 d调理牛排的总DNA。
1.3.3.2 PCR扩增
PCR扩增采用带GC夹子的特异性引物U968-GC（CG CCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCA CGGGGGGGAACGCGAAGAACCTTAC）和L1401（CGGTGTGTACAAGACCC）对细菌16S rDNA的V6～V8区进行PCR扩增。25μL PCR扩增体系为：2×Taq Master Mix 12.5μL，DNA模板1μL，引物（10μmol/L）各1.5μL，ddH2O 8.5μL。PCR扩增程序：95℃预变性10 min；95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，32个循环；最后72℃再延伸10 min。
1.3.3.3 DGGE
使用8%聚丙烯酰胺凝胶，采用40%～60%的变性胶。将灌好胶的玻璃板放入电泳槽内升温至60℃，130 V预跑胶20 min。点样20μL，200 V、90 mA高压预跑胶10 min后，85 V、50 mA恒压下电泳16 h。电泳结束后，将变性胶放入50 mL 1×TAE电泳缓冲液（含5μL Gel-Green DNA染色剂）染色30 min。用ddH2O漂洗2～3次后用化学发光仪系统拍照。
1.3.3.4 DGGE条带回收与测序
将变性胶置于紫外条件下，用无菌手术刀切下各泳道的主要条带，溶于盛有20μL TE缓冲液的PE管中，4℃过夜提取DNA。以回收的DNA为模板，以U968（AACGCGAAGAACCTTAC）（无GC夹子）和L1401（CGGTGTGTACAAGACCC）为引物进行扩增。PCR扩增体系和条件同1.3.3.2节。
1.3.4 CEO、CSEO、BPEO抑菌性能测定
1.3.4.1抑菌圈直径
将优势腐败菌接种于LB琼脂培养基，37℃培养24 h。用无菌生理盐水调节制成106 CFU/mL的菌悬液，置于4℃冰箱备用。用无菌棉签蘸取菌液，在培养基上划线涂布。将6 mm的无菌空白药敏纸片放置于培养基上，分别滴加10μL CEO、CSEO、BPEO，每皿4片，以无菌生理盐水为空白对照。在4℃冰箱中放置4 h，使精油在含菌平板上自纸片中心向外围扩散，随后放入各温度培养箱培养16～24 h。用游标卡尺测量抑菌圈直径。抑菌作用判断：抑菌圈直径＞20 mm为高度敏感；10～20 mm为中度敏感；6～10 mm为低度敏感；＜6 mm为无抑菌作用。重复3次实验均有抑菌作用的结果判为合格。
1.3.4.2最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentrate，M I C）和最小杀菌浓度（m i n i m u m b a c t e r i c i d a l concentrate，MBC）
采用二倍稀释法测定精油的MIC与MBC。分别吸取一定量的CEO、CSEO、BPEO，加入1%（V/V）吐温-80无菌水溶液，使其体积浓度为64μL/mL。吸取1 mL上述植物精油溶液，加入LB培养基，将其体积浓度依次稀释为32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5μL/mL，最后一管移取1 mL植物精油溶液。每个试管中加入等体积的菌悬液，在培养箱中培养16～24 h，若溶液呈现澄清状态，对应的植物精油体积浓度则为MIC。蘸取澄清试管中的溶液划线，24 h未长菌的植物精油体积浓度即为MBC。
1.3.4.3细菌生长曲线
各精油的细菌生长曲线通过光密度测定，吸取一定量的植物精油和菌悬液置于酶标板，使精油体积浓度分别为MIC和2MIC，放入培养箱培养，每隔2 h取出测定OD600 nm。实验重复操作3次，每次设置3个平行，记录并绘制生长曲线。
1.4数据处理
使用IBM SPSS Statistics 26.0对实验数据进行单因素方差分析，结果用平均值±标准差表示，并以Duncan检验进行显著性（以P＜0.05为差异显著）标记。
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