禽呼肠病毒(Avian reovirus，ARV)是呼肠病毒科、正呼肠病毒属的成员，为双链RNA病毒，无囊膜，含10个节段，双衣壳结构，可感染鸡、火鸡、鹅、鸭及一些鸟类，临床主要症状包括病毒性关节炎、腱鞘炎、肠道病、矮小综合征、吸收不良综合征及免疫抑制等，是家禽养殖业中一类重要的传染病，严重危害着养殖业的健康发展。
ARV于1954年由Fahey和Crawley从病鸡中分离得到；Olson等于1957年报道鸡群中有滑膜炎并分离出病原，1972年被确定为禽呼肠病毒。自20世纪80年代以来，我国各省份及地区陆续报道了ARV感染的疫情，对ARV的研究也日渐深入，Vanderheide等用ARV S1133株生产出了第一代的商品化活疫苗应用于生产；2012年起，我国ARV感染疫情逐渐扩大，主要症状也呈现复杂化、多样化。目前，养殖场普遍存在ARV感染，给养禽业带来了不可估量的经济损失，严重阻碍养禽业的发展。研究表明，ARV的细胞亲嗜性较广，能在绿猴肾细胞(Vero)、犬肾细胞(MDCK)、鸡胚成纤维细胞(CEF)、乳地鼠细胞(BHK-21/13)等多种细胞系中增殖，且产生稳定典型细胞病变。丁明洋等用鸭呼肠病毒TH11感染BHK-21细胞后可有效增殖，出现了稳定病变；黄莉等用ARV强、弱毒株分别接种Vero细胞，并分析了接毒后细胞蛋白表达的差异；余爱花等研究了3株鸭源ARV对鸭胚成纤维细胞的致病性，分析了接毒后细胞TNF-α表达水平的差异性。
有关ARV的研究已经较为深入，但研究ARV在DF1细胞上的增殖特性还未见报道，本文就此展开研究。通过将ARV S1133毒株接种DF1细胞，研究其增殖特性，旨在为下一步ARV致病机理的研究和细胞灭活苗的研制奠定技术和理论基础。
1材料与方法
1.1材料
DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、2.5 g/L胰酶,Gibco公司产品；PBS，Solarbio公司产品；禽呼肠S1133标准强毒株，中国兽医药品监察所提供；DF1细胞，由广西兽医生物技术重点实验室保存提供。
1.2方法
1.2.1引物设计及合成
参考NCBI上的ARV S1133株S2基因的核苷酸序列(登录号：KF741763.1)，用Primer 5.0软件设计引物，并由华大基因公司合成，引物序列见表1。
1.2.2 ARV S1133接种
DF1细胞将ARV S1133接种至生长良好的DF1细胞上，37℃孵育2h，更换维持液(含20 mL/L FBS的DMEM培养基)，在体积分数为5%的CO2中37℃培养，观察CPE。培养3 d后收细胞培养物，置-80℃冻存备用。取上述病毒液再接种细胞，培养3 d后收获细胞培养物，重复接毒3次。置-80℃冻存备用，测定第3代细胞培养物中的病毒滴度。
表1 ARV S2基因的核苷酸序列
1.2.3 RT-PCR检测
收获接毒后培养48 h的第3代细胞培养物，提取病毒RNA，用ARV通用引物反转录得到cDNA，将其作为模板用表1中的特异性引物进行PCR扩增，预期扩增片段大小为1 248 bp。PCR程序为94℃5 min；94℃1 min，55℃1 min，72℃70 s，循环数为35；72℃10 min。PCR产物用10 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.4一步生长曲线的绘制
将上述收获的第3代病毒液接种DF1细胞，分别收取接毒后12、24、36、48、72、96、120 h的病毒液，置-80℃冻存备用。将DF1细胞接种在96孔细胞板上，在体积分数为5%的CO2中37℃过夜培养，观察CPE及记录CPE孔数(重复此过程3次)。按Reed-Meunch法计算7个时间段的半数组织感染量(TCID50)(取3次重复试验的平均值)，绘制ARV在DF1细胞上的一步生长曲线。
相关新闻推荐
1、苦荞蛋白对肠球菌、肠杆菌、产气荚膜梭菌生长抑制作用及机理（一）