2结果与分析
2.1调理牛排腐败菌分离鉴定结果
对腐败末期调理牛排的微生物进行分离纯化，结果如表2所示。从6种传统培养基中共分离纯化得到10株菌，其中PDA、STAA培养基各1株，VRBA、CFC、PCA、MRS培养基各2株。但是，采用培养基分离筛选出的菌株往往不能代表微生物的真实分布情况，也无法仅凭此判断优势腐败菌。因此，优势腐败菌的确定还需要进一步验证。
表2调理牛排腐败菌的形态结构及鉴定结果
2.2 PCR-DGGE分析调理牛排菌群变化
DGGE指纹图谱上的1个水平条带代表1个微生物类群，条带越多表示样品中的微生物多样性越丰富。其中，条带越亮，则表示该种菌的数量相对越多。调理牛排作为冷鲜食品，其最佳食用期为2～3 d。从第3天开始，牛肉品质开始下降，表面略微变绿，质地松散，回弹缓慢，处于次鲜肉，已不适宜消费者食用。从4 d开始，肉制品底部渗出恶臭血水，不能食用。Sul等在研究牛肉的贮藏期时也发现了相似的变化。因此，提取调理牛排6 d内的总菌落DNA，进行DGGE，分析菌落的变化及微生物演替过程。
图1显示，在4℃低温贮藏过程中，微生物菌群具有一定的差异性和动态演替。在贮藏初期（1～3 d），样品还在可食用范围内，样品中的初始菌相并不复杂，微生物数量不多，这说明冷藏起到了暂时性的保鲜效果，延缓了细菌的繁殖速率。随着贮藏时间延长，条带由少变多，在末期还出现了一些新的条带。但是，条带1、2、3贯穿整个贮藏期，且亮度并未随着时间的延长而变暗。在后期，条带4、5、6、7、8开始逐渐由暗变亮，这说明冷藏能够在一定程度上抑制这些微生物生长，但并不能完全抑制。随着贮藏时间延长，抑菌效果逐渐减弱，微生物快速繁殖，导致调理牛排加速腐败变质。因此，确定条带1、2、3为调理牛排的优势腐败菌。
图1调理牛排腐败期细菌16S rDNA V6～V8区基因的PCR-DGGE指纹图谱
2.3 DGGE分离鉴定结果
如表3所示，在DGGE谱图中，条带较弱的DNA未检测出菌株类别，只检测到菌属水平。其中条带1、2、3分别为深蓝紫色杆菌、恶臭假单胞菌和热杀索丝菌，即调理牛排中的优势腐败菌。先前的研究结果表明，假单胞菌属是导致冷鲜肉产生不良气味和腐败变质的主要菌群。
表3 PCR-DGGE条带的基因片段序列比对结果
2.4 3种植物精油的抑菌性能评价
2.4.1抑菌圈直径测定结果
通过测定3种植物精油对优势腐败菌的抑菌圈直径，初步筛选出具有优良抑菌效果的植物精油。由表4可知，CEO对3株腐败菌均有明显抑菌性。其中，对热杀索丝菌的抑制效果最为显著（P＜0.05），抑菌圈直径为13.900 mm。CSEO的抑菌效果稍弱，对深蓝紫杆菌的抑菌性显著高于其他菌（P＜0.05）。而BPEO对3株菌均无抑菌效果。因此，可以初步判断CEO的抑菌性最强。吴天琳比较60种植物精油对立枯丝核菌、核盘菌、灰葡萄孢等6种植物病原真菌的体外抗菌活性，发现CEO对6株菌的抑制率最高，均达到100%；CSEO抑菌性稍弱，抑制率最高为69.54%；黑胡椒精油抑菌性最弱，抑菌性最高为55.28%。
表4 CEO、CSEO和PBEO对优势腐败菌的抑菌圈直径
注：—.没有抑菌圈；同列小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
综上，可以初步判断，CEO的抑菌效果最强。这可能是由于其主要成分为丁香酚、百里香酚、肉桂醛和石竹烯等芳香环和酚类物质，能够与膜蛋白相互作用，诱导生物分子从细胞内部流失，影响电子传递、酶活性和蛋白质合成，从而抑制微生物生长繁殖。有相关研究报道，酚类物质在不同体积浓度下对微生物的抑菌机制有所差异。在低体积浓度下，酚类物质的抑菌性能主要通过抑制酶活体现，而在高体积浓度下则通过诱导蛋白质变性实现高效抗菌。CSEO的主要成分是黄酮类、生物碱和花青素，通过攻击细菌细胞膜，引起细菌内蛋白质、ATP和DNA的泄漏。而深蓝紫色杆菌和恶臭假单胞菌均属于革兰氏阴性菌，细胞膜外层的肽聚糖作为细胞保护结构，从而减缓了CSEO的抑菌性。
2.4.2 MIC与MBC测定结果
MIC和MBC为抑制病原微生物繁殖或杀灭病原微生物的最小药物浓度。由表5可知，总体来看，CEO的MIC和MBC最低，2μL/mL的精油添加量就具备明显的抑菌效果。3种优势腐败菌中，CSEO对深蓝紫色杆菌的抑菌效果最强，这与上述抑菌圈结果一致。在精油添加量为最大体积浓度（32μL/mL）时，CSEO与恶臭假单胞菌、热杀索丝菌的细菌培养液在培养16～24 h后仍然浑浊，说明在此精油添加量下，CSEO没有发挥出抑菌效果。通过抑菌圈、MIC和MBC实验结果可以明确，BPEO对3株优势腐败菌均未表现出抑菌效果，所以通过细菌生长曲线进一步比较CSEO、CEO的抑菌性能强弱。
表5 CEO、CSEO、BPEO对优势腐败菌的MIC和MBC
注：—.在最高精油添加量下试管溶液浑浊。
2.4.3优势腐败菌生长曲线
OD600 nm可以直接或间接反映样品中细菌的生长情况。由图2可知，未被CEO处理的各优势腐败菌生长情况符合典型的细菌生长曲线。由图2a可知，MIC和2MIC体积浓度的CEO在8 h内就能抑制90%的深蓝紫色杆菌生长，并且在较长时间内使其维持较低的生长活性。相比之下，2MIC体积浓度的CEO具有更强的抑制效果，在12～20 h还能持续降低细菌的OD600 nm。从图2b可以明显观察到，恶臭假单胞菌的细菌生长趋势为空白对照组＞MIC处理菌悬液＞2MIC处理菌悬液，与热杀索丝菌一致（图2c），都证明CEO能够有效抑制优势腐败菌的生长。
图2 CEO对深蓝紫色杆菌（a）、恶臭假单胞菌（b）、热杀索丝菌（c）生长曲线的影响
由图3a可知，2MIC体积浓度的CSEO能够作用于深蓝紫色杆菌的对数生长期，使其生长繁殖受到抑制。抑菌圈实验表明，CSEO对热杀索丝菌和恶臭假单胞菌具有低敏抑菌性。但在进行MIC和MBC实验时，即使在最大精油添加量下，CSEO对2株优势腐败菌均未表现出抑菌性。因此，以最大精油添加量（32μL/mL）进行细菌生长曲线实验，进一步研究CSEO对这2株菌的生长抑制效果。由图3b、c可知，添加精油的细菌生长曲线与对照组一致，无抑菌性。综上所述，针对3株优势腐败菌，CEO为抑菌性最强的植物精油。
图3 CSEO对深蓝紫色杆菌（a）、恶臭假单胞菌（b）、热杀索丝菌（c）生长曲线的影响
3结论
通过传统培养基分离腐败菌株，结合PCR-DGGE技术对调理牛排腐败贮藏过程中微生物的消长规律和菌群变化进行检测，明确优势腐败菌为深蓝紫色杆菌、恶臭假单胞菌和热杀索丝菌。针对优势腐败菌，再通过抑菌圈、MIC、MBC和细菌生长曲线从CEO、CSEO和BPEO 3种香辛料植物精油中筛选出抑菌性最强的植物精油为CEO，为后续调理牛排的防腐保鲜提供了参考。