摘要:为筛选最适于牛支原体(Mycoplasmabovis)生长的培养基，利用活菌计数方法测定了牛支原体OF2株在改良Thiaucourts培养基、牛心汤培养基和改良KM2培养基中的生长曲线。结果发现，牛支原体在改良Thiaucourts培养基中生长30h即可达到平台期，平均最高生长滴度7.0×109ccu/mL;在牛心汤培养基中生长40h即可达到平台期，平均最高生长滴度4.0×109ccu/mL;在改良KM2培养基中生长50h达到平台期，其平均最高生长滴度为7.0×108ccu/mL。结果表明，牛支原体在改良Thiaucourts培养基中生长快、滴度高，为下一步牛支原体灭活疫苗的研究提供了参考依据。
牛支原体(Mycoplasmabovis)是引起牛的肺炎、关节炎、乳房炎、角膜结膜炎等病的病原体之一。该病原体于1961年首次在美国患有乳房炎的病牛中分离出来，目前在欧洲和北美洲流行并造成了严重的经济损失。2008年，我国部分地区新从外地引进肉牛暴发了由M.bovis引起的以坏死性肺炎为主要特征的传染性牛支原体肺炎疫情，发病率为50%~100%，迄今该病原体已在贵州、宁夏、内蒙古、广西、重庆等省、市、自治区被发现。疫苗是有效防制动物传染病的重要手段之一，但目前我国尚无有关牛支原体疫苗研究的报道。筛选生长快、滴度高的培养基是灭活疫苗生产工艺研究中的一个重要环节。本试验通过测定牛支原体国内分离株OF2在不同基础液配方的支原体培养基中的生长曲线，以期筛选出合适的牛支原体制苗用培养基，为下一步牛支原体灭活疫苗的研究奠定基础。
1、材料和方法
1.1菌株及培养基
牛支原体OF2株，2010年分离自宁夏某地患肺炎犊牛肺组织，参照文献的方法对其进行特异性PCR和16SRNA基因测序分析鉴定为牛支原体，本实验室冻干保存。
改良Thiaucourts培养基，配方为:PPLO肉汤(21g/L)、灭活马血清(200mL/L)、25%酵母浸出液(100mL/L)、10%醋酸铊(1mL/L)、青霉素(0.1g/L)、葡萄糖(1g/L)、丙酮酸钠(2g/L)、0.4%酚红(4.5mL/L)。
牛心汤培养基，配方为:1%水解乳蛋白Hank's液(562.5mL)、牛心汤(337.5mL)、马血清(100mL)、25%酵母浸出液(20mL)、10%醋酸铊(10mL)、0.4%酚红(1.8mL)、青霉素(20万U)。
改良KM2培养基，配方为:MEM(5g)、葡萄糖(0.4g)、丙酮酸钠(0.2g)、水解乳蛋白(5.1g)、灭活马血清(200mL)、25%酵母浸出液(20mL)、10%醋酸铊(1mL)、0.4%酚红(1mL)、青霉素(20万U)。
以上所配培养基均用1moL/LNaOH调pH至7.4~7.8，4℃保存备用。
1.2方法
1.2.1培养基适应性试验取-72℃冻存OF2株菌种3支，分别接种上述3种培养基进行复苏、传代，根据培养基颜色变化情况记录支原体生长情况。
1.2.2生长曲线测定
1)菌液培养。将-72℃冻存的OF2菌种移入5mL的改良Thiaucourts、牛心汤和KM2培养基中复苏，复苏后按体积比1∶20传代约3~5代，待生长稳定后扩大培养到50mL，作为待测菌液，置37℃温箱中培养，从0h起每隔5h进行活菌计数。
2)活菌计数与生长曲线绘制。每隔相应的时间从待测菌液取样，采用活菌梯度稀释计数法进行计数。具体方法是:将改良Thiaucourts、牛心汤和改良KM2培养基各分装于96孔细胞培养板，每孔270μL。第1孔加入待测菌液30μL，吹打混匀后，取30μL加入第二孔中，依次重复以上操作至第10孔，混匀后取30μL弃去。由此待测菌液被稀释为10-1、10-2、10-3至10-10不同的稀释度。每种培养基的操作步骤相同，每个时间点分别做3个平行孔，将细胞培养板置于湿盒中37℃恒温培养，以未接种菌液的培养基为阴性对照，将pH调至6.8的培养基作为阳性对照。每天观察接种孔的颜色变化，直至孔颜色不发生变化为止，最后一个变色孔的稀释度即为待测菌液的生长滴度，用颜色变化单位(Colorchangeunit，ccu)表示。分别用3份样品的平均滴度(x，n=3)表示该时间点支原体平均生长滴度。以取样时间点为横坐标，平均生长滴度的对数为纵坐标，绘制生长曲线。
2、结果
2.1培养基适应性试验结果
培养试验结果表明，牛支原体OF2株在3种培养基中均可生长。记录传代稳定后各培养物的颜色变化，结果见表1。从表1可知OF2株在改良Thiaucourts培养基中生长速度快，12h即可观察到颜色变化，至30h已完全变黄;在牛心汤、改良KM2培养基中分别需18h、24h肉眼可见生长(颜色变化)。在36h时对培养物进行了计数，结果OF2株在改良Thiaucourts培养基、牛心汤培养基中生长滴度均可达到109ccu/mL，而在改良KM2培养基中仅为107ccu/mL。
2.2生长曲线的测定结果
牛支原体OF2株在改良Thiaucourts培养基、牛心汤培养基和改良KM2培养基中的生长滴度变化见表2，并据此绘制了生长曲线图(图1)。从表2和图1中可以看出，牛支原体OF2菌株在改良Thiaucourts培养基中平均生长滴度最高可至7.0×109ccu/mL，在30h左右到达平台期，30~50h之间滴度可维持在109ccu/mL数量级。牛支原体OF2菌株在牛心汤培养基中最高生长滴度可至4.0×109ccu/mL，在40h左右进入平台期，40~55h之间滴度可维持在109ccu/mL数量级。牛支原体OF2菌株在改良KM2培养基中生长相对缓慢，在50h左右进入平台期，平均生长滴度最高为7.0×108ccu/mL。
3、讨论
由于支原体基因组小，自身合成能力较弱，体外培养时所需营养要求高，培养条件较为严格，因此筛选成本较低且利于牛支原体生长的培养基对牛支原体灭活疫苗的研究具有重要的意义。常见的支原体培养基常在3种不同的基础液配方上进行改良而来:PPLO，如Eatons、Thiaucourts培养基等;牛心汤，如Hayfilcks、A62培养基和本试验所用的牛心汤培养基等;富含氨基酸和维生素的人工基础液，如Freys、改良Freys培养基和改良KM2培养基等。本实验室此前曾对丝状支原体山羊亚种、绵羊肺炎支原体等支原体最适培养基进行了筛选，发现不同的支原体其最适培养基并不一致。因此有必要观察牛支原体在这3种不同基础液配方的培养基上的适应情况和生长表现。结果表明，牛支原体在改良Thiaucourts培养基中生长快、滴度高，适合于灭活疫苗生产过程中菌体的培养。当然，就所测得的生长曲线而言，本试验结果仅是实验室阶段小量培养得到的数据，在进行中试规模或生产规模的牛支原体培养或发酵罐生产时可作为参考依据，但扩大规模后尚需要进一步进行有关工艺条件的研究。
另外，从培养基材料来源和成本分析，KM2培养基和Thiaucourts培养基中的材料均为商业化试剂，来源方便且质量可控;而牛心汤培养基中的牛心汤目前国内尚未见商品，常由实验室从屠宰场购置后自行制造，除了有生物材料污染的风险以外，没有相关质量标准也不符合当前农业部发布的有关兽用疫苗研制指导原则。因此，从这两方面看，改良Thiaucourts培养基应作为牛支原体灭活疫苗研制的首选培养基。