2、结果与讨论
2.1菌株的分离鉴定及生长特性
2.1.1菌株的形态学特征
从酱香型白酒堆积酒醅中共筛选到179株菌株，结合《伯杰细菌鉴定手册》《常见细菌系统鉴定手册》和德国微生物与细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,DSMZ,https://www.dsmz.de/collection/catalogue/details/culture/DSM-45196)，平板菌落形态初步确定有3株潜在克罗彭斯特德菌，编号为K.eburnea 1613、K.eburnea 1615、K.eburnea 6E22，其菌落形态基本一致，以菌株K.eburnea 1613为例，在TSB固体培养基上45℃培养48 h后，菌落呈象牙色，扁平状，形态不规则，边缘呈波浪状，表面无光泽，生长到后期菌落呈放射状，褶皱状，有土腥味(图1A)。通过冷场扫描电镜观察，菌株K.eburnea 1613的菌丝呈长的弯曲状，在不分枝的菌丝顶端上发育单个内生孢子，菌丝体大小约(0.3−0.5)µm⊆(4.0−6.0)µm(图1B)。
图1菌株Kroppenstedtia eburnea 1613的菌落形态(A)和冷场扫描电镜图(B)
2.1.2菌株的分子生物学鉴定
将菌株的16S rRNA基因序列提交到EzBioCloud数据库比对，结果显示K.eburnea 1613、K.eburnea 1615和K.eburnea 6E22均与模式菌株Kroppenstedtia eburnea DSM 45196T相似度最高，分别为99.16%、98.76%和98.95%，与模式菌株Kroppenstedtia guangzhouensis GD02T的相似度分别为95.88%、95.82%和95.61%。已有研究定义潜在新物种的16S rRNA基因序列相似度阈值为98.65%。系统发育分析显示3株菌与Kroppenstedtia eburnea DSM 45196T聚为一支(图2)。因此，综合菌株形态特征和16S rRNA基因序列分析，将菌株K.eburnea 1613、K.eburnea 1615和K.eburnea 6E22鉴定为Kroppenstedtia eburnea。
图2基于16S rRNA基因序列的邻近法系统进化树
2.1.3菌株的生长曲线
生长曲线测定结果表明，3个菌株在0−16 h生长速度缓慢，处于延滞期；培养至18 h生长迅速，进入对数生长期；在32 h左右进入平稳期，OD600为2.8−3.2。菌株K.eburnea 1613 pH在整个生长过程中呈上升趋势，从初始7.46变化为8.46(图3B)。菌株K.eburnea 1615、K.eburnea 6E22终点pH值为7.70，与初始pH值相比变化不显著(P>0.05)。
图3菌株在45℃、pH 7.50条件下的生长特性A：OD600.B：pH
2.2菌株发酵液中挥发性化合物分析
2.2.1挥发性化合物大类组成
采用HS-SPME-GC-MS方法在菌液中共检出97种挥发性化合物，包括17种醇类、16种吡嗪类、13种醛类、12种酮类、10种酯类、6种酚类、5种酸类以及18种其他类化合物。菌液挥发性化合物总相对浓度为(10.05±0.38)–(22.17±1.37)mg/L(图4A)。与空白对照组相比，菌株K.eburnea 1613的菌液中挥发性化合物含量是其1.88倍(P<0.01)，而菌株K.eburnea 1615和K.eburnea 6E22与对照差异不显著(P>0.05)。吡嗪类物质在各菌株发酵液中占比最大，为49.68%–70.35%，其中菌株K.eburnea 1613占比最高，达到70.35%(图4B)。空白对照组中吡嗪类物质含量为(5.45±0.17)mg/L，菌株K.eburnea 1615和K.eburnea 6E22菌液中吡嗪类物质浓度分别为(5.95±0.07)mg/L和(6.26±1.19)mg/L，与对照组差异不显著(P>0.05)，而K.eburnea 1613中吡嗪类浓度为(14.53±0.99)mg/L，显著高于对照组(P<0.01)，是对照组的2.66倍，说明菌株K.eburnea 1613能促进吡嗪类物质的产生。
图4菌液挥发性化合物相对浓度(A)及百分占比(B)
2.2.2各类挥发性化合物分析
为了比较菌株K.eburnea 1613、K.eburnea 1615和K.eburnea 6E22在纯培养条件下的挥发性化合物含量差异，对每个物质进行Z-score标准化并绘制成热图(图5)，其中对照(control)为未接种的空白培养基。3株菌的发酵液中所含挥发性化合物的成分有明显差异，菌株K.eburnea 1613发酵液中吡嗪类、酮类、酸类、醇类和酚类物质普遍明显高于菌株K.eburnea 1615和K.eburnea 6E22。
图5纯培养条件下菌株各类挥发性化合物聚类热图分析
吡嗪类物质是胺和羰基化合物发生美拉德反应产物之一，空白培养基中吡嗪类物质占比为49.68%，推测是由于培养基中物质之间发生美拉德反应的产物。相较于对照，菌株K.eburnea 1613中检测出的2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪和2-乙基-3,6-二甲基吡嗪的含量都显著上升，分别是其1.5、5.5和16.0倍，再次表明菌株K.eburnea 1613能促进吡嗪类物质的生成。此外，菌株K.eburnea 1613发酵液中检出2-壬酮、2-庚酮和2-十一酮等7种酮类化合物，而在K.eburnea 1615和K.eburnea 6E22中未检出，其中2-壬酮和2-庚酮具有花果香和清甜气味；酸类物质仅在K.eburnea 1613发酵液中检出，含量为(0.16±0.09)mg/L；醇类含量也明显高于对照和另外2株菌。菌株K.eburnea 1615和K.eburnea 6E22中检出的3,5-二叔丁基苯酚含量高于其他组，分别为(2.01±0.04)mg/L和(2.03±1.18)mg/L。另外，各菌株发酵液中均检测到了不同种类的酯类物质，例如，K.eburnea 1613中检测到癸酸甲酯、十三酸甲酯和12-甲基十三烷酸甲酯，这些酯类呈花果香的气味。综上所述，菌株K.eburnea 1613能显著提高各类挥发性风味化合物的产生，包括吡嗪类、酮类等，这些物质有利于酱香型白酒典型风味的形成。
2.3固态发酵高粱中挥发性化合物分析
不同发酵方式对于微生物的生长和代谢具有重要影响，因此，为更好地探究微生物在堆积酒醅中的生长和代谢特点，进一步进行了恒温固态发酵高粱实验。
2.3.1不同温度固态发酵高粱中挥发性化合物大类组成
采用HS-SPME-GC-MS方法在发酵高粱中共检出89种挥发性化合物，包括23种酯类、14种酮类、11种醛类、12种醇类、11种酸类、2种酚类以及16种其他类化合物。挥发性化合物的含量随着发酵时间的延长呈现上升趋势(图6)。菌株K.eburnea 1613、K.eburnea 1615和K.eburnea 6E22在50℃发酵15 d时发酵高粱中检出的挥发性化合物总含量均高于45℃，其中主要为醇类和酸类，它们的总含量呈现明显的上升趋势。菌株K.eburnea 1615在发酵第15天时挥发性化合物含量最高，45℃和50℃时分别为(67.79±18.72)µg/g和(72.79±0.58)µg/g(图6A、6B)。
图6 45℃(A)和50℃(B)下菌株固态发酵高粱中挥发性化合物相对含量及其占比
2.3.2不同温度固态发酵高粱中挥发性化合物分析
为比较菌株K.eburnea 1613、K.eburnea 1615和K.eburnea 6E22在不同温度下的固态发酵高粱各类挥发性化合物含量差异，将各类挥发性物质进行Z-score标准化并绘制成热图(图7)。结果表明，菌株K.eburnea 1615在50℃发酵15 d时醇类物质含量最高，为(33.69±0.34)µg/g，是对照组的3.08倍，其中含量最高是苯乙醇，含量为(31.17±0.14)µg/g。与对照相比，3株菌均促进了苯乙醇的产生，尤其是K.eburnea 1615(图7A)。苯乙醇具有玫瑰花香的气味和抗真菌活性，可能在酱香型白酒堆积过程中抑制真菌的生长。高级醇是指3个及以上碳原子的一元醇，是白酒中重要的呈味化合物，如苯乙醇、异戊醇等，含量太低会导致白酒酒体单薄，过量会让酒体苦涩，容易上头。在白酒酿造中高级醇的合成主要是氨基酸分解代谢途径(Ehrlich途径)和氨基酸合成代谢途径(Harris途径)。
图7恒温发酵高粱中不同类别挥发性化合物分析
A：醇类.B：酸类.C：酯类.D：醛类.E：酮类.F：其他类.G：酚类
与对照相比，菌株K.eburnea 1613、K.eburnea 1615在酸类物质积累上具有明显优势，主要为异戊酸，其次是己酸。K.eburnea 1615在第15天时总含量最高，为(27.50±1.04)µg/g，异戊酸含量为(16.75±0.76)µg/g。酸类物质具有协调香气的作用，适量的酸可使白酒酒体丰满、回味悠长。同时，酸类是合成酯类不可或缺的前体，酯类物质通常具有花香、果香、甜香等愉悦的风味特征，对白酒风味有着积极的作用，例如，异戊酸酯化形成的异戊酸乙酯具有似苹果等的水果香。此外，相较于45℃，菌株在50℃积累更多酸类物质。例如，K.eburnea 1615在50℃发酵15 d时5-甲基己酸和丁酸的含量分别为(4.41±0.03)µg/g和(0.88±0.01)µg/g，是45℃的1.57倍和1.72倍；菌株K.eburnea 1613在50℃发酵15 d时己酸含量为(3.74±0.19)µg/g，是45℃的2.73倍(图7B)。然而，高温可能不利于酯类物质的积累，从总体上看，菌株在50℃发酵条件下的酯类物质含量普遍低于45℃(图7C)。例如，K.eburnea 1615在45℃发酵7 d时，酯类物质含量最高，为(8.01±4.01)µg/g，是50℃的4.97倍。另外，45℃对照组中部分酯类物质积累明显，如棕榈酸甲酯、癸酸乙酯，可能是高粱原料本身中物质转化形成的。
醛酮类物质种类丰富，主要是发酵过程微生物代谢及醇类物质氧化、酮酸脱酸等产生。醛酮类共检出25种，主要有苯甲醛、壬醛、异佛尔酮和仲辛酮等(图7D、7E)。苯甲醛和异佛尔酮分别是含量最高的醛类和酮类，前者具有苦杏仁气味，后者具有薄荷气味。固态发酵过程中醛类物质总含量无明显变化，对照组中主要的醛类物质含量高于其他3组，说明一定温度下高粱自身可能会释放醛类物质。然而，3个菌株组中苯乙醛在发酵过程逐渐增加，至15 d时含量为(0.92−1.32)µg/g，高于对照组，苯乙醛具有苦杏仁的气味。酮类物质在发酵至15 d时明显积累，其中在50℃条件下对照组中酮类含量为(4.92±1.00)µg/g，是45℃的2.03倍，表明50℃可能促进高粱原料产生酮类物质。菌株K.eburnea 1615在45℃发酵15 d时酮类总量最高，为(5.38±1.30)µg/g，是对照的2.09倍，其中，异佛尔酮的积累量最高，为(4.82±1.19)µg/g，是对照的22.95倍。结果表明，堆积发酵过程中高温有助于醛酮类物质的积累，菌株K.eburnea 1615在45℃也能提高酮类物质的含量，推测醛酮类的产生是温度和微生物共同作用的结果。
吡嗪类物质具有典型的烤香味、坚果味，被认为是酱香型白酒的重要风味物质。共检出4种吡嗪类物质，含量最高的为2,5-二甲基吡嗪(图7F)。3个菌株的2,5-二甲基吡嗪含量均高于对照组，在50℃下的积累量高于45℃，其中50℃第7天时菌株K.eburnea 6E22中检出的2,5-二甲基吡嗪含量最高，为(1.67±0.14)µg/g，是45℃下的1.05倍。高温有利于美拉德反应，进而产生更多的吡嗪类物质。酚类物质在对照组中含量较高，3,5-二叔丁基苯酚在45℃发酵15 d时含量最高，为(4.88±0.94)µg/g，可能源于高粱自身物质的分解(图7G)。此外，菌液和发酵高粱中检出的挥发性化合物的含量和种类不同，可能是由于底物组成不同造成的，纯培养条件中TSB培养基主要以胰蛋白胨和葡萄糖为氮源和碳源，红缨子高粱中主要是质量分数为69.88%的支链淀粉和7.43%蛋白质，其次发酵方式的不同也可能对微生物的生长代谢产生影响。综上所述，象牙色克罗彭斯特德菌有助于堆积发酵酒醅风味化合物的产生，特别是醇类、酸类和吡嗪类等酱香型白酒特征风味物质。
酱香型白酒堆积酒醅中分离克罗彭斯特德菌生长和挥发性化合物代谢特征（一）
酱香型白酒堆积酒醅中分离克罗彭斯特德菌生长和挥发性化合物代谢特征（二）
酱香型白酒堆积酒醅中分离克罗彭斯特德菌生长和挥发性化合物代谢特征（三）