近日，兰州大学环境微生物课题组联合上海交通大学生命科学技术学院以及斯坦福大学在环境领域TOP期刊Environmental Science&Technology上发表了题目为“Novel Feruloyl Esterase for the Degradation of Polyethylene Terephthalate(PET)Screened from the Gut Microbiome of Plastic-Degrading Mealworms(Tenebrio Molitor Larvae)”的文章。第一作者为2023届博士毕业生吐尔逊阿依（现就职于新疆农业大学草业学院），通讯作者为韩华雯青年研究员和李祥锴教授。
聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）是最常用的合成聚合物之一，在日常生活中发挥着不可或缺的作用。全球每年生产近7000万吨PET塑料，广泛应用于纺织品、包装和容器的制作。PET是一种石油衍生品，由乙二醇（EG）和对苯二甲酸乙酯（TPA）组成，其高度耐微生物或酶降解。与其它处理方法相比，微生物降解塑料由于成本低、环保等优点，成为了塑料处理领域中最具前景的替代方案。典型PET降解细菌主要是从分离自塑料污染的环境，如Ideonella sakaiensis和Pseudomonas aestusnigri，其可分泌PET水解酶IsPETase和PE-H。然而，这些野生型PET降解酶的环境适应性差，且活性较低，限制了大规模工业应用。大多数PET降解酶主要筛选自塑料污染富集的生境（如垃圾填埋场、活性污泥及海洋环境），其发掘过程主要以报道的IsPETase和枝叶堆肥角质酶LCC作为参比序列，从而将PET降解酶“筛选池”限定在较窄的序列空间。鉴于此，采用创新的筛选策略深入探索未知生态位，有助于发掘并鉴定出新型塑料降解酶。
昆虫的食性选择经历漫长的过程，其肠道微生物短时间内无法进化出塑料降解酶。我们之前的研究发现，以玉米秸秆(CS)和聚苯乙烯(PS)为食的黄粉虫肠道菌群结构相似。作为有机聚合物，木质纤维素和塑料在多个维度展现出相似性，包括疏水性、结晶度和化学键等方面。塑料中主要的化学键包括C-C键（例如，在PE，PP和PVC的主链中）和酯键(例如，在PET中)。木质素是一种高度非均相的芳香族聚合物，通过酯键与半纤维素和纤维素链接形成复杂的木质纤维素网络结构。值得注意的是：水解酶家族蛋白展现出了对木质纤维素及含有酯键塑料（如PET与聚乳酸PLA）的非凡活性。因此，我们假设黄粉虫幼虫肠道微生物中参与木质纤维素降解的酶可能具备降解PET的能力。为了验证这一假说，本研究聚焦于黄粉虫幼虫肠道微生物中与木质纤维素降解密切相关的基因序列，筛选出兼具阿魏酸活性的新型PET降解酶TmFae-PETase。
本研究提供了一种新的筛选PET降解酶的策略，为从木质素降解相关环境中发掘新型塑料降解酶奠定了基础，从而拓宽了现有的塑料降解酶库，将推动其在塑料污染治理中的应用潜力。
1.从木质纤维素降解酶中筛选PET降解酶
属于CAZy家族的大多数蛋白具有木质纤维素降解能力。根据黄粉虫幼虫肠道微生物宏基因组基因注释，共有808个基因被归类为CEs类，具体来说，CE1和CE10家族的丰度最高，总共包含428个基因（图1a-b）。研究人员通过一系列筛选标准，包括氨基酸序列相似性低于85%、氨基酸序列长度超过200个氨基酸，以及完整的开放阅读框（ORF）序列，最终筛选出22个候选基因。通过构建这些基因与已知纤维素降解酶的系统发育树，研究人员随机选择了5个来自不同分支的候选基因进行后续研究（图1c-e）。基因编号后两位为15和96的蛋白是不溶性蛋白，其他三个蛋白分别是07、74和55为可溶性蛋白。（图1f）。三丁酸甘油酯平板水解圈实验结果发现蛋白07和74并未有明显的水解圈，而蛋白55则显示出与已报道的酶LCC一致的水解圈（图1e）。其次，三种蛋白（07，74，55）对PET塑料的降解能力测试结果显示，只有蛋白55出现与PET降解产物MHET和TPA标准品一致的峰，且产生的MHET和TPA的峰面积随时间而增高（图1h-i）。SEM结果显示，经蛋白55处理后的PET膜表面出现了明显的点蚀和气孔（图1j,k）。此外，FTIR结果进一步表明，与未处理的PET塑料相比，经蛋白55处理的PET的代表疏水性基团（R-OH:3200-3800 cm-1）和C=O键（1500-2000 cm-1）发生了变化（图1l）。这说明酶处理后的PET疏水性变弱，且C=O键被酶破坏。以上实验结果均证明蛋白55具有PET塑料降解功能。
图1.黄粉虫肠道微生物群中PET降解酶的生物信息学筛选。黄粉虫幼虫。(a)黄粉虫肠道微生物宏基因组中碳水化合物活性酶(CAZymes)主要类别的比例；(b)CE家族的相对丰度；(c)候选酶的筛选标准；(d)22个基因和已知木质纤维素降解酶的系统发育树；(e)5个选定候选酶的生物信息；(f)蛋白SDS-PAEG凝胶电泳图；(g)在三丁酸甘油酯琼脂板上酶周围形成的水解圈；(h,i)PET降解产物MHET和TPA的HPLC色谱图；(j,k)未处理(CK)和酶55处理PET薄膜的SEM图；(l)未处理和酶55处理PET薄膜的FT-IR光谱图。
2.TmFae-PETase阿魏酸酯酶活性以及CS降解能力
PDB库比对结果显示，蛋白55在结构上与阿魏酸酯酶LP_0796展现出了最高的相似性（相似性为48%），因此将编号为55的蛋白命名为TmFae-PETase。TmFae-PETase与gf-PET在30°C下孵育10天后，共产生97.8μM的PET降解产物MHET和TPA(图2a,d)。TmFae-PETase的阿魏酸酯酶活性测试结果表明TmFae-PETase可以水解阿魏酸甲酯（MFA）和咖啡酸甲酯（MCA），并随着反应时间的推移，水解产物阿魏酸（FA）和咖啡酸（CA）的浓度增加（图2b,c）。TmFae-PETase对MCA的降解速度比MFA快，反应2h后CA的产生量高于FA或其他时间段，而随着时间的推移，FA的释放量越来越高（图2e,f）。GC-MS结果显示，经酶处理的CS中出现了9-十八烯酸(Z)-甲酯（C19H36O2），而未处理组CS没有出现该产物（图2h）。先前的研究报道，长链脂肪酸如9-十八烯酸是木质纤维素的降解中间产物。此外，FTIR结果进一步显示，酶处理组和未处理组CS样品的光谱出现显著差异。在3400 cm−1处出现了强的吸收峰，这代表木质素中芳香族和脂肪族R-OH的拉伸振动（图3i）。
图2.PET降解酶TmFae-PETase的表征。(a−c)TmFae-PETase在PET、MFA和MCA水解过程中释放产物的HPLC谱图;(d−f)TmFae-PETase的PET、MFA和MCA水解活性;(g)TmFae-PETase对PET和MFA底物的偏好测试;(h)TmFae-PETase处理CS降解产物的GC-MS色谱图;(i)TmFae-PETase处理和未处理的CS样品的FT-IR光谱。注:CS=玉米秸秆。
新筛选PET塑料降解酶表征、降解能力、最佳条件、实际应用（一）
新筛选PET塑料降解酶表征、降解能力、最佳条件、实际应用（二）