1、材料与方法
1.1样品采集与富集培养
原位聚球藻于2020年8月在渤海B12(38.87°N，119.67°E)和黄海H19(33.00°N，124.01°E)站位采集。利用CTD采样器(Sea-Bird 911Plus，Sea-Bird，美国)采集2~5 m水深的海水100 mL，经48μm筛绢预过滤后用3μm针管过滤器过滤至含放线菌酮(0.05 mg·mL–1)的50 mL SNAX培养基中进行富集培养。富集培养条件为:温度25℃，光照强度50μmol·m–2·s–1，光照周期12D:12L。
1.2培养实验方法
在无菌条件下，分别将100 mL的富集培养藻液B12和H19于7 386 r/min、4℃条件下离心20 min，接种于无氮组分海盐(Aquavitro，美国海化)配制的1 L改良的SNAX培养基中(硝酸盐浓度为实验组浓度，铵盐浓度为1.0μmol·L–1，其余成分浓度不变)。参照实际海域营养盐状况，实验设置4个硝酸盐浓度组，分别为0.1、1.0、10.0、100.0μmol·L–1，每个实验组设置3个平行。实验从第6 d开始采取半连续培养方式，每间隔24 h从培养瓶中取出250 mL培养基并补充250 mL新鲜培养基。实验持续15 d，期间每24 h测定藻细胞密度，至实验结束测定聚球藻的色素含量、光合作用参数以及体系中的碳氮含量。
1.3分析测定方法
1.3.1聚球藻富集样品的鉴定
取富集样品1.40 mL，加入多聚甲醛(终浓度为0.5%)固定后，采用流式细胞仪(BD FACS Jazz，美国)根据前向散射光(FSC)、侧向散射光(SSC)、叶绿素a(FL-1，488 nm)、藻红蛋白(FL-2，585 nm)和藻蓝蛋白(FL-3，640 nm)荧光信号鉴定聚球藻及其色素类型。另取500 mL富集样品过滤至0.22μm聚碳酸酯滤膜(Millipore Co.，美国)，采用高通量测序分析聚球藻的系统发育分类。具体方法为使用DNA快速提取试剂盒(Fast DNAspin kit，MP BIO，美国)抽提DNA，以聚球藻特异性引物rpoC1-39F/rpoC1-462R扩增RNA聚合酶γ亚单位编码基因。PCR反应条件为:95℃预变性3 min;35个循环(95℃30 s，55℃30 s，72℃45 s);72℃延伸10 min，4℃保存。扩增产物在Majorbio有限公司(上海，中国)使用PE300 Illumina MiSeq测序平台进行测序。序列经fastp v0.20.0质控，FLASH v1.2.7拼接后，使用UPARSE v7.1剔除嵌合体，与NCBI数据库中的相似序列比对并以原绿球藻的PCC9511为外群，采用最大似然法用MEGA X构建系统进化树。原始数据保存至NCBI SRA数据库(序列号:SAMN26533762-SAMN26533769)。
1.3.2藻细胞密度测定
采用流式细胞术测定聚球藻细胞密度，方法同1.3.1。参照文献方法计算聚球藻细胞的比生长速率和最大比生长速率。
1.3.3叶绿素a和藻胆蛋白含量测定
取藻液40 mL，用甲醇法提取叶绿素a(Chl a)后，用分光光度计(Lambda 25，PerkinElmer，美国)根据665 nm和652 nm处的吸光值计算叶绿素a浓度。另取藻液40 mL，用超声破碎法提取藻胆蛋白，以PBS缓冲液为空白，测定565 nm、620 nm和650 nm处的吸光值，按照公式(1-3)计算分别藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)和藻红蛋白(PE)的浓度。
式中，A620、A650和A565分别表示620、650和565 nm处的吸光值，cPC、cAPC和cPE分别表示PC、APC和PE的浓度(mg·mL–1)。
1.3.4光合生理参数测定
取藻液3 mL，暗适应15 min后使用Aqua Pen手持式藻类叶绿素荧光仪(WALZ，德国)测量量子产率(Qy)和最大光化学效率(Fv/Fm)值。测量光、饱和脉冲光及光化光分别设置为0.018、1 800和600μmol·m–2·s–1。
1.3.5营养盐及碳、氮含量测定
取藻液10 mL，经0.45μm滤膜过滤至10 mL离心管中，利用连续流动分析仪(AA3，Seal Analytical，德国)测定铵盐(NH4+)，硝酸盐(NO3–)，亚硝酸盐(NO2–)和磷酸盐(PO43–)的浓度。另取藻液10 mL，经0.45μm滤膜过滤至酸洗棕色玻璃瓶中，利用全自动总有机碳分析仪(TOC-VCPH，Shimadzu，日本)测定总有机碳(TOC)、总无机碳(TIC)和总氮(TN)的含量。
1.4数据分析
使用FlowJo 10.6.2软件分析流式细胞仪获得的数据，使用Origin 2018进行绘图，使用SPSS 26.0软件对数据进行单因素方差分析(ANOVA)和t检验，设置显著性水平为P<0.05。