牛肠道病毒（Bovine enterovirus，BEV）属于小RNA病毒科、肠道病毒属，病毒粒子呈球形，无囊膜，直径30~40 nm。BEV为不分节段的单股正链RNA病毒，基因组全长约7500 nt，包括5'非编码区（5'untranslated region，5'UTR）、一个开放阅读框（open reading frame，ORF）及3'非编码区（3'untranslated region，3'UTR）。ORF编码一个大的多聚蛋白，经过一系列酶解后产生结构蛋白（VP1、VP2、VP3和VP4）和非结构蛋白（2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D）。
BEV感染牛一般引起轻度的腹泻症状，也可侵犯其他器官而引起呼吸系统疾病或流产，同时存在隐性感染。从患腹泻、肺炎、呼吸系统疾病及生殖障碍疾病的牛分泌物或排泄物中可分离获得BEV，也可以从正常牛的粪便样品中分离出。
1959年Moll和Davis首次分离获得BEV，随后很多国家和地区相继报道了BEV的分离鉴定。国外牛群中BEV的血清学阳性率为17.6%~80%。中国有关BEV的病原学及流行病学调查相对较少。2011年李英利等首次在中国国内报道了牛肠道病毒的分离鉴定，随后又从北京市分离到1株牛肠道病毒。2013年彭小薇等从北京市某牛场严重腹泻的泌乳奶牛直肠拭子中分离获得1株牛肠道病毒，并进行了全基因组序列测定。2013年第九次病毒分类报告将BEV重新分类为EV-E与EV-F。分子进化树分析表明以上2株牛肠道病毒中国分离株（BHM-26、BJ50和BJ001）均为EV-F2。2014年邢泽黎等从吉林省肉牛场新发疫病分离出E种肠道病毒。2015年张海丽等从山西省某奶牛场的泌乳奶牛粪便样品中分离得到1株牛肠道病毒，分析其可能为EV-E。
本实验室2017年1月从内蒙古发生呼吸道疾病的某牛场采集牛鼻拭子，用MDBK细胞进行病毒分离，获得1株病毒。经电镜观察、理化特性鉴定和序列分析表明该分离株为牛肠道病毒，命名为NM575，这是国内首次从表现呼吸道疾病的牛鼻拭子中分离到牛肠道病毒。
1材料和方法
1.1病料
内蒙古某牛场发生呼吸道疾病，病牛表现精神沉郁、流涕、咳嗽和呼吸窘迫等症状。采集30头牛的鼻拭子于含3%小牛血清的MEM中，冰袋保存并迅速运回实验室。
1.2主要试剂
MDBK细胞由本实验室保存；基因组提取试剂盒、胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒均购自AXYGEN公司；反转录酶和pMD18-T载体购自TaKaRa公司；dNTP、DEPC水、DNA Marker（DL2000）均购自Thermo公司。
1.3样品处理与病毒分离
将鼻拭子浸出液经0.45µm滤器过滤后接种于24孔板培养的MDBK单层细胞，每孔100µL，37℃、5%CO2培养箱中吸附2 h后换液，逐日观察细胞病变（cytopathic effect，CPE）。未出现CPE的盲传3代后，出现CPE后继续传代，当CPE达到80%时收毒，－70℃保存。
1.4病毒含量的测定（TCID50）
将分离株F4用维持培养液稀释至10-9，每个稀释度做8个重复，接种96孔细胞培养板中的MDBK细胞（100μL/孔），并设正常细胞对照，置37℃、5%CO2培养箱中培养。每天观察细胞病变，共培养4 d，记录细胞病变孔数，根据Reed-Muench法计算TCID50。
1.5电镜观察
将分离病毒接种MDBK细胞，待80%出现CPE后反复冻融3次收毒，2400×g离心15 min，取上清，再经4℃、13 800×g离心30 min，取沉淀，2%磷钨酸负染，进行电镜观察。
1.6病毒的理化特性鉴定
对该病毒进行核酸型鉴定、乙醚敏感性试验、氯仿敏感性试验、胰蛋白酶敏感性试验、耐热性试验、耐酸性试验等理化特性鉴定。
1.6.1病毒的核酸型鉴定
将MDBK传至96孔板，待其长至单层，将已知的RNA病毒牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3）和DNA病毒牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）与分离的病毒NM575，分别用含100µg/mL的DNA抑制剂5-溴脱氧尿苷（BRDU）的维持液稀释至100 TCID50，然后接种至MDBK细胞，同时设100µg/mL BRDU细胞对照组。每日观察CPE，48 h后收获细胞培养物，反复冻融3次后，接种至96孔板上长至单层的MDBK细胞，48 h后记录CPE情况并计算TCID50。
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