1.材料与方法
1.1材料与仪器
人参市售6年新鲜人参，产地吉林；小鼠单核巨噬细胞RAW264.7（CL-0190）、人非小细胞肺癌细胞A549（CL-0016）、Ham，s F-12K（WHB823P231）、RAW264.7专用培养基（WHAA23G033）购自武汉普诺赛生命科技有限公司；LPS（S11060）购自上海源叶生物科技有限公司；BCA蛋白测定试剂盒（P0012）、细胞周期试剂盒（C1052）、细胞凋亡试剂盒（C1062M）购自上海碧云天公司；反转录试剂盒（AU341）、基因扩增试剂盒（AQ601）购自全式金生物科技有限公司；β-Actin Rabbit mAb（AP0060）、TLR4 polyclonal antibody（BS91353）、MyD88 Rabbit monoclonal antibody（BS40219）、iNOS Rabbit monoclonal antibody（BS40374）、COX-2 polyclonal antibody（BS90326）购自Bioworld；NF-κB P65 Rabbit mAb（8242T）购自美国CST；FITC anti-mouse CD80 antibody（104705）购自Biolegend。
Infinite 200 Pro酶标仪瑞士TECAN公司；111型二氧化碳培养箱美国Thermo公司；IX73荧光显微镜日本Lympus公司；1645050型蛋白凝胶电泳仪美国BIO-RAD公司；FL1000 iBright智能成像系统美国赛默飞世尔科技有限公司；CFX96荧光定量PCR仪美国BIO-RAD公司
1.2实验方法
1.2.1人参外泌体的提取纯化
1.2.1.1人参外泌体的提取
对鲜参中的人参外泌体进行提取，具体提取纯化方法如下：将人参清洗干净，在匀浆器中加入PBS匀浆，过滤，加入蛋白酶抑制剂，使用1 mol·L−1 Tris-HCl调人参液的pH至7，在转速为400×g、800×g和10000×g条件下离心20 min取上清液，再用超速离心机在100000×g下离心1 h，用20 mmol·L−1 Tris-HCl重悬并充分涡旋沉淀。
1.2.1.2人参外泌体的纯化
二浓度蔗糖垫纯化：配制1 mol·L−1、2 mol·L−1蔗糖溶液，在离心管内依次加入样品溶液、1 mol·L−1和2 mol·L−1蔗糖溶液，100000×g离心1 h，轻轻吸取样品层，然后加入20 mmol·L−1的Tris-HCl至全管，100000×g离心1 h，洗去多余的蔗糖，再用20 mmol·L−1的Tris-HCl重悬并充分涡旋沉淀，获得纯化的人参外泌体。本课题组通过透射电子显微镜观察人参外泌体，结果显示，纯化后的外泌体形态均一，粒径集中在317.90±4.43 nm，其外部有明显的双层膜结构，整体呈大小不一的茶托样或半球样结构，符合外泌体显微鉴别特征；通过BCA试剂盒测定纯化后人参外泌体蛋白质的浓度，根据不同浓度牛血清白蛋白标准品在562 nm处的吸光度值绘制标准曲线，根据标准曲线计算得出纯化后人参外泌体的收率为103 mg/kg。
1.2.2细胞培养及条件培养基的制备
RAW264.7细胞使用RAW264.7细胞专用培养基养，置于37℃和5%CO2的细胞培养箱中培养。RAW264.7细胞培养24 h，阳性组给予1µg·mL−1的LPS刺激，给药组加入浓度5、10、20µg·mL−1的人参外泌体，培养24 h，收集细胞培养上清液，以2000 r/min离心10 min，并通过0.22µm细胞滤网过滤，制备成条件培养基（CM）。A549细胞使用含10%胎牛血清、1%链霉素和青霉素的Ham's F-12K培养基培养，A549细胞铺板，培养24 h，弃去上清液，加入条件培养基2 mL后共培养24 h。
1.2.3人参外泌体对RAW264.7细胞活力的测定实验
收集对数生长期RAW264.7细胞，以密度为2×104个/mL接种于96孔细胞培养板中，在恒温培养箱中培养24 h；设置实验分组：空白对照组；阴性对照组（20 mmol·mL−1的Tris-HCl）；阳性对照组（1µg·mL−1的LPS）；人参外泌体给药组（人参外泌体浓度为5、10、20μg·mL−1），每组设置6个复孔，24 h后，在避光条件下，加入CCK-8，37℃孵育30 min；在波长为450 nm处检测各孔OD值。细胞存活率计算公式如下：
式中；A0为空白组的OD值；A样本为实验组的OD值；A空白为对照组OD值。
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