黄曲霉菌(Aspergillusflavus)是一种土壤腐殖真菌，玉米、花生等谷类收获前后都会腐烂作物的种子。黄曲霉最适生长温度范围为25～42℃，其中最适毒素产生温度为28℃。这些真菌会导致食物变质，甚至还会产生有剧毒的毒素，其中黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)因其对肝的毒性和极强的致癌性而备受关注。动物食用含有黄曲霉毒素的谷物，严重情况可导致死亡，人类长时间食用含低浓度黄曲霉毒素的食物被认为是导致胃癌、肝癌、肠癌等疾病的主要原因。黄曲霉毒素对人类和牲畜造成严重的健康问题，因此超过100多个国家在食品与饲料中严格限制毒素水平，其中用于人类和奶牛的玉米受到最严格限制，为20/1 000 000 000。近年来，尽管引进了新的抗真菌药物和防腐剂，但是由于耐药性和环境污染逐渐增加，寻找安全可靠的抗真菌药物引起全世界研究者的兴趣。
姜黄素(C21H20O6)是从姜黄根茎中提取的小分子量疏水多酚类化合物，也是姜黄的主要成分，具有抗菌、抗炎、抗肿瘤等广泛的药理活性。姜黄素被世界卫生组织、联合国粮食及农业组织归列为食品添加剂，也是我国在《食品添加剂使用卫生标准》(GB 2760—1981)中最早颁布的，是在食品中被允许使用的9种天然色素之一。姜黄素作为天然光敏剂，对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、拟茎点霉、灰霉等致病菌均有抑制效果。由于姜黄素良好的抑菌效果，在食品安全领域得到人们的关注和重视。
1实验材料和方法
1.1材料和试剂
黄曲霉菌株(JXZS-117-1)由中国农业科学院油作物研究所惠赠;姜黄素(纯度≥98%)购自Sigma-Aldrich(St.Louis，USA)。
1.2实验方法
1.2.1孢子萌发率和芽管长度
在90 mm的培养皿中加入10 mL的PDA，取100μL收集的孢子液并用玻璃涂布棒在平板表面涂抹均匀。放置在28℃的恒温培养箱中静置培养12 h。在光学显微镜下观察萌发情况。记录和计算平板上孢子的芽管长度和萌发率，萌发率计算公式如下:
其中:S1为总的孢子个数;S2为萌发的孢子个数。
1.2.2抑菌剂对致病菌生长抑制效果
根据文献[11]的方法，将在马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，PDA)培养基培养7 d正常生长的黄曲霉使用5 mm打孔器，取菌饼于含0.3 mmol/L的姜黄素PDA的培养皿正中央，在空白对照组中只加入PDA。将样品放入28℃的恒温培养箱中培养3 d。观察并测量黄曲霉菌落直径。每个处理重复3次，进行3次实验。
1.2.3毒素检测
在10 mL的试管中加入5 mL的马铃薯葡萄糖培养液(potato dextrose broth，PDB)，添加姜黄素使最终浓度为0.3 mmol/L，加入100μL已过滤的5×105个/mL的黄曲霉孢子液，然后放置在转速为180 r/min、温度为28℃的恒温摇床中。在摇床中培养7 d后收集菌丝和培养液。将收集的菌丝在50℃的烘箱中烘干水分并不时地记录菌丝质量，待质量不再变化记录最终菌丝干重。
将去除菌丝的培养液加入到50 mL的离心管中并加入1 g NaCl，用pH=7的磷酸缓冲液稀释至25 mL，将溶液震荡混匀并超声30 min，过滤备用。准确量取5 mL滤液加入到免疫亲和柱中，然后将免疫亲和柱接到5 mL的注射器下，调整注射器流速使溶液以2 mL/min的流速缓慢流过免疫亲和柱，再以2 mL/min的流速用0.1%吐温/PBS清洗，用10 mL的蒸馏水清洗2次。弃去全部流出的液体，并将3 mL的空气注入免疫亲和柱，再用2 mL的色谱级甲醇洗脱毒素，收集洗脱液。洗脱液用0.22μm的有机相过滤器过滤收集。准确吸取300μL的样品加入样品收集瓶中待测。液相条件为:流动相为甲醇和水(体积比为70∶30)，流速1 mL/min，柱温40℃。荧光检测激发波长360 nm，发射波长440 nm。
计算单位质量菌丝产生的毒素，计算公式为:
T=10c/m
其中:T为单位菌丝产生的毒素量;c为毒素的检测浓度;m为菌丝的干质量。
1.2.4洋葱穿透实验
准备一个新鲜、无损伤的洋葱，用刀片在内表皮上切出一个边长1 cm的正方形，用无菌的镊子剥去洋葱的表皮，将撕下的洋葱内表皮装入含有50 mL无菌水的培养瓶中。密封之后将培养瓶放置在68℃的水浴锅中加热1 h以杀死洋葱细胞。加热结束后使用无菌蒸馏水将内表皮清洗2遍，清除表皮上的多余组织。配制5×105个/mL的黄曲霉孢子液，并在孢子液中加入姜黄素使其浓度为0.3 mmol/L，设置不含有姜黄素的空白对照。然后用移液枪取100μL的孢子液加入到洋葱表皮，将孢子液在表皮涂抹均匀。将处理后的洋葱表皮放置在培养皿中保湿、避光、室温下孵育12 h后，加入0.25%的台盼蓝染液染色4 min，然后用移液枪小心地除去染液，再吸取无菌蒸馏水吹洗掉剩余的染液。最后制片在普通光学显微镜下观察拍照。
1.2.5侵染花生实验
准备孢子悬浮液并用血球计数板计数，制成5×105个/mL的孢子液100 mL。将花生粒称重记录，用1%的次氯酸钠浸泡1 min，取出后用无菌水冲洗2次，放置在超净台吹干。将花生放入孢子液中浸泡30 s，取出后放置在含少量无菌水滤纸的培养皿中，将培养皿放置在28℃恒温培养箱中培养7 d。对照组是用未处理的黄曲霉孢子液浸泡，设置空白对照。每个处理重复3次，进行3次实验。
1.2.6花生感官评价
为了评价姜黄素的加入对花生的感官是否会产生影响，对加入姜黄素的花生进行感官评价。具体操作为:将花生加入到0.3 mmol/L的姜黄素中进行浸泡，使用清水浸泡的花生做空白对照，浸泡结束后将花生放置在通风处晾干，2 d后将部分姜黄素处理的花生进行清水清洗。实验邀请13位人员对花生进行感官评价，通过对样品仔细观察、嗅闻和品尝，对各项指标进行评分，具体评价标准见表1所列。
表1花生感官评价标准
1.2.7抑菌剂对病原菌形态学的影响
从7 d正常生长的黄曲霉菌板中截取菌饼，加入到含无菌水的培养瓶中，振荡充分，用两层擦镜纸进行过滤，取10μL菌液放置在血球计数板中进行计数，获得5×105个/mL的孢子液;然后在添加0.3 mmol/L姜黄素的PDA培养皿中，吸取100μL的孢子液加到培养皿中，用玻璃涂布棒将孢子液涂抹均匀，放置在28℃的恒温培养箱中培养7 d;再将处理后的黄曲霉菌重新提取孢子，加入含姜黄素的平板中，进行连续3代的培养并观察菌落形态和色素产生情况。每个处理重复3次，进行3次实验。
1.2.8黄曲霉菌对姜黄素的耐受性分析
为了探究黄曲霉菌对姜黄素的长期处理会不会产生耐受性，在含有0.3 mmol/L姜黄素的PDA平板上培养黄曲霉菌，待产孢后观察菌落形态并收集孢子，用无菌水过滤黄曲霉孢子，制成5×105个/mL的黄曲霉孢子悬浮液;取100μL孢子悬浮液加入到含姜黄素和不含姜黄素的PDA板中，然后用玻璃涂布棒涂抹均匀。将接种好的平板放置在28℃的培养箱中，培养7 d。第7天收集平板上的孢子过滤，得到第1代姜黄素处理的孢子液;继续将得到的孢子液在姜黄素处理的平板中连续培养3代，获得第3代姜黄素处理后的黄曲霉孢子。然后使用第3代孢子进行花生侵染实验。每个处理重复3次，进行3次实验。
1.3数据分析
所得数据使用Excel 2013进行统计计算，并用SPSS 17.0进行方差分析(ANOVA)，计算平均值之间是否存在显著性差异用Duncan多重检验法，P<0.05认为差异显著，不同字母表示不同处理之间具有显著性差异。文中柱状图使用Origin 8.0进行绘制。