组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDI）是一类特异性抑制组蛋白去乙酰化酶、促进染色质解螺旋、增强其趋近性，从而调节基因转录的小分子化合物。体内、外研究证明组蛋白去乙酰化酶抑制剂可通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡、抑制肿瘤血管生成及转移、降低肿瘤侵袭力等机制发挥抗肿瘤作用，与放射联合还有放射增敏作用。
近来研究表明，异羟肟酸有组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑制剂活性，可抑制多种肿瘤细胞生长。异羟肟酸被广泛称为低毒性HDAC抑制剂。Tambunan US等研究提出了利用苯三唑对异羟肟酸修改，获得一个更好的抑制剂。本研究观察异羟肟酸对宫颈癌Hela和Siha细胞株生长和细胞周期的影响及p53mRNA和蛋白表达改变。
1.材料与方法
1.1材料
异羟肟酸购自Sigma公司，用PBS稀释成500mmol/L，过滤分装，贮藏于-20℃。P53抗体购自Santa Cruz公司，为鼠抗人单抗。RPMI-1640（Gibco公司）。TRIZOL试剂购自Invitrogen公司。新生牛血清（杭州四季青）。FACSort流式细胞仪为美国Becton Dickson公司产品。四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）（Sigma）；AnnexinV-FITC凋亡和细胞周期分析试剂盒为Becton Dickinson公司产品。
1.2实验方法
1.2.1细胞和细胞培养
Hela和Siha细胞株由本科室保存。细胞在5%CO2、37℃条件下，用含10%新生牛血清、青霉素（100U/ml）、链霉素（100U/ml）的RPMI-1640培养液培养传代。
1.2.2 MTT实验检测生长抑制率
取对数生长期宫颈癌细胞，按细胞浓度为5×104/孔接种于96孔板。37℃、5%CO2饱和湿度培养24h后，分别加入不同浓度SAHA（0，1.2，2.4，5.0 mM）的培养基，每孔200μl，对照组不做处理。分别于加药后0、1、2、3和4天，每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20μl，37℃避光培养4h。彻底吸去MTT溶液，加入二甲基亚砜150μl/孔，震荡10min，酶标仪490nm激发波长检测吸光度。计算细胞的生长抑制率。细胞生长抑制率（%）=（1-实验组吸光度值/对照组吸光度值）×100%。每次实验设3复孔，实验重复3次。
1.2.3流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡和细胞周期
Hela细胞和Siha细胞分别用含（0，1.2，2.4，5.0 mM）SAHA的培养基培养48h。胰酶消化成单细胞悬液，1 000r/min离心5min收集细胞，加0.01mol/L PBS洗涤离心2次，用4℃75%乙醇固定过夜。1 000r/min离心5min，去掉乙醇固定液，PBS洗涤2次。加入PI染液1ml（50μg/mlPI、20μg/ml RNase、0.1%Triton-100），4℃孵育30min，FCM检测凋亡细胞率。
1.2.4 RT-PCR检测p53表达
分别收集用含（0，1.2，2.4，5.0 m M）SAHA处理48h的细胞。用TRIZOL提取细胞总mRNA，参照说明书进行。提取的mRNA用紫外分光光度计检测RNA的纯度和浓度（A260/A280>1.8）。取2μg mR-NA为模板，应用通用引物逆转录合成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增。P53引物：正义链5′-cctcttcggcccagtggac-3′，反义链5′-ccgttttcgaccctgagag-3′，退火温度60℃，共28个循环，扩增产物369bp；β-actin引物：正义链5′-ggcatcgtgatggactccg-3′，反义链5′-gctggaaggtggacagcga-3′，退火温度62℃，共28个循环，扩增产物594bp。扩增条件为：94℃预变性3 min；94℃40 s，56℃40 s，72℃1min，30个循环；72℃延伸7 min。取PCR产物5μl在1.5%琼脂糖凝胶上电泳（100 V，30 min）。凝胶成像系统成像，经薄层扫描求得每个待测产物与β-actin产物光密度之比，进行半定量分析。PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，电泳结果用英国UVP公司GDS8000型全自动图像分析系统处理。
1.6 Western blot分析p53蛋白表达水平分别收集0，1.2，2.4，5.0 m M SAHA处理72 h的细胞，提取蛋白质，采用Bradford法定量蛋白质，取50μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳。然后电转膜到硝酸纤维素膜上。室温下摇动封闭4h。TBS-T洗涤3次，加一抗（p53按1∶100稀释）在4℃下过夜。室温下洗膜后加入辣根过氧化物酶偶联兔抗小鼠IgG抗体，洗去未结合的二抗，滴加化学发光剂ECL进行发光显影。TBS-T洗涤3次，再用二抗（1∶5 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG）振荡孵育2h。采用化学发光法（ECL）显影。
1.3统计学处理
计量资料用均数±标准差（±s）表示，用SPSS11.5软件进行统计，数据比较采用t检验，单变量多组资料之间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。
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