3、结果与讨论
3.1.抗真菌活性
生物膜的形成与念珠菌属引起的慢性感染有内在联系。许多研究证实，固着细胞对大多数可用抗生素的敏感性降低（Mah&O'Toole，2001，Périchon，2009，de la Fuente Nunez et al.，2013）。因此，发现和开发新的治疗药物至关重要。天然产物能够在生物膜的所有阶段干扰生物膜的形成。它们可以影响环境的物理化学性质，改变细胞膜的结构或干扰生物膜形成的调节系统。所有这些过程都会干扰细胞粘附和生物膜的形成。由于天然物质与生物膜的相互作用机制复杂且往往具有属特异性，因此必须根据特定微生物和条件对其进行评估和描述。
本研究选择了已知干扰生物膜形成的天然物质。低浓度黄芩素（4–32μg ml−1）能够抑制白色念珠菌生物膜的形成（Cao等人，2008年，Sardi等人，2013年），壳聚糖对多种微生物具有抗菌活性，包括白色念珠菌生物膜（Carlson等人，2008年，Francolini&Donelli，2010年，Martinez等人，2010年）。Pires等人（2012年）将松萝酸描述为一种有效的副硅藻固着细胞生长抑制剂。
它们对所研究的拟青霉和克鲁西青霉菌株的抗真菌活性被确定为最小抑制浓度，如表2所示。观察到的MIC在两种物种的通常观察值范围内（Canton等人，2003年）。
表2拟青霉和克鲁西青霉对两性霉素B、黄芩素和壳聚糖的敏感性测定为MIC。
为了评估受试化合物对固着细胞的活性，进行了一系列浓度范围的初步实验，有效浓度的结果如图2所示。化合物效应以百分比（条形图）表示，与对照实验相关，分配为100%，因此低于100%的值表示细胞覆盖面积降低，超过100%的值表示物质影响增加生物膜覆盖的情况。评估后选择的二值图像（黑色区域代表生物膜）位于条形图下方，所有图中生物膜生物量的排列：物质效率对抗粘附（A行）；防止生物膜形成的物质效率（图片B行）；针对预形成生物膜的物质效率（图片C行）。每幅图像都是一组平铺图像，显示了一口井的中心表面。这是Cellavista评估的25幅图像的汇编。在所研究的天然化合物中，壳聚糖和黄芩素在低浓度下都会影响粘附或预形成的生物膜，但松萝酸即使在300μg ml的浓度下也没有表现出足够的抗生物膜性能−因此被排除在其他试验之外（单向方差分析：C.parasilosis粘附抑制P=0.67，生物膜发育P=0.014，预形成生物膜P=0.15）。在两种研究微生物的所有对照实验中，生物膜的排列是一致的。在大多数情况下，这些物质会均匀地影响和降低覆盖面积，但黄芩素除外，即使在总覆盖面积降低的情况下，黄芩素的存在也会导致簇状物的形成（以白色圆圈突出），尤其是在副硅藻的生物膜发育实验中（B行，第二列）。
图2：。所选物质在最低抑制浓度（MIC）下对副硅藻土链球菌和克鲁西链球菌生物膜形成的影响。黑条（图像A行）：物质抗粘附效率；深灰色条带（图像B行）：物质对生物膜形成的效率；浅灰色（图像C行）：物质对预先形成的生物膜的效率。所有图像都是一个代表井的瓷砖。比例尺=400μm。
3.2.抗生素对生物膜的影响
两性霉素B是用于真菌感染的标准抗生素，但其肾毒性是这种治疗中最严重的问题。此外，这种药物通过细胞膜的渗透性差，这也是该药物给患者的剂量增加的原因，这有助于真菌耐药性的发展。与之前的研究（Baillie&Douglas，1998，Douglas，2003）一样，我们的结果（图3）证实，两性霉素B促进预先形成的生物膜的进一步生长，而不是将其根除，但与浓度为3μg ml的对照组相比，它能够抑制约60%的微生物粘附−1，比副硅藻土悬浮细胞的MIC高两倍。另一方面，即使在浓度为5μg ml时，两性霉素B也能减少克氏梭菌固着细胞预形成生物膜的定殖面积−1（悬浮细胞比MIC高两倍）。在最高测试浓度（20μg ml）下，其对微生物粘附的抑制效果仅为35−1).两性霉素B对所研究微生物的生物膜发育没有显着影响，也不影响生物膜的排列（未显示图像）。
图3：。两性霉素B对拟青霉和克鲁西青霉生物膜形成的影响。黑条：抗粘附物质效率；深灰色条形图：物质对生物膜形成的有效性；浅灰色：物质对预先形成的生物膜的效率。比例尺=400μm。
3.3.天然物质对生物膜的影响
尽管之前已经报道了黄芩素对念珠菌属悬浮细胞的抗真菌活性以及对白色念珠菌的抗生物膜活性（Cao等人，2008年），并且Serpa等人（2012年）和Sardi等人（2013年）研究了黄芩素对副青霉悬浮细胞的影响，但黄芩素对副青霉和克鲁西青霉的抗生物膜活性数据仍然不足。
为了更详细地评估黄芩素的抗生物膜活性，黄芩素在三个不同阶段对生物膜形成的影响如图4所示。黄芩素对所研究的每一种念珠菌菌株的效力是不同的。在副硅藻土中观察到预成生物膜生物量的较高减少，而这并不影响生物膜的排列。即使在20μg ml浓度下，也观察到约60%的预形成生物膜抑制−1个在副硅藻土C−1在C.krusei中（单因素方差分析，P˂0.001）。在拟青霉中，观察到黄芩素对生物膜排列和簇形成的影响（图4中白色圆圈突出显示的簇）。黄芩素抑制拟青霉生物膜的形成（单向ANOVA，P=0.005），但对克鲁西青霉无显着影响（单向ANOVA，P=0.074）。当浓度低于MIC-50μg-ml时，观察到超过30%的微生物粘附抑制−1个用于副硅藻酸杆菌，60μg ml−1对于克鲁西梭状芽胞杆菌细胞，通过单因素方差分析（P˂0.001）证实了两种微生物结果的显着性。黄芩素在所有研究的实验装置（粘附、生物膜发育和预形成的生物膜）中诱导C krusei生物膜中的簇形成，在较高浓度的C.parasilosis中。
图4：。黄酮类黄芩素对拟青霉和克鲁西青霉生物膜形成的影响。黑条（图像A行）：物质抗粘附效率；深灰色条带（图像B行）：物质对生物膜形成的效率；浅灰色（图像C行）：物质对预先形成的生物膜的效率。所有图像都是一个代表井的瓷砖。比例尺=400μm。
壳聚糖的抗菌作用以及低分子量壳聚糖水凝胶的抗真菌和抗生物膜特性已在前面介绍过（Cobrado et al.，2013，Silva Dias et al.，2014）。壳聚糖似乎是一种非常有效的微生物粘附抑制剂或生物膜还原剂。实验证明，壳聚糖水凝胶能够显着减少体内外念珠菌生物膜的形成。尽管生物膜结构存在巨大差异，不仅在不同物种的菌株之间，而且在同一物种的菌株之间，壳聚糖活性在同一物种内通常是一致和恒定的（Silva Dias et al.，2014）。
使用一种新的方法——Cellavista自动显微镜评估和随后的图像分析，我们证实了准硅藻土梭菌和克鲁西梭菌的这一结果（图5），并补充了描述壳聚糖对生物膜形成影响的数据。与之前的研究相反，我们的结果显示，壳聚糖在明显较低的浓度下（40μg-ml时，粘附力降低60%）对拟青霉粘附抑制有显着的抑制作用（单向方差分析，P˂0.001−1）尤其是克氏梭菌（20μg ml时下降80%）−1，经单因素方差分析证实，P˂0.001）。在物质对生物膜发育的自然影响条件下，壳聚糖对拟青霉无影响；在生物膜生长的这一阶段，壳聚糖甚至增加了克鲁西链球菌的生物膜形成。壳聚糖对副硅藻土芽孢杆菌的清除作用最大为30%（在40μg-ml浓度下），副硅藻土芽孢杆菌仅影响预形成生物膜中的固着细胞−1）在25μg-ml浓度下，克氏狸殖吸虫预形成生物膜的清除率为40%左右−1).壳聚糖对C.parasilosis和C.krusei生物膜的清除效果显着（单因素方差分析，P=0.015）。
图5：。多糖壳聚糖对拟青霉和克鲁西青霉生物膜形成的影响。黑条（图像A行）：物质抗粘附效率；深灰色条带（图像B行）：物质对生物膜形成的效率；浅灰色（图像C行）：物质对预先形成的生物膜的效率。所有图像都是一个代表井的瓷砖。比例尺=400μm。
Cellavista基本上是一种自动显微镜，可以将单个图像合并成更大的单位。然后，对如此创建的较大区域的所创建的构图进行图像分析。根据已发表的著作（Lindstrom et al.，2009，Duverger et al.，2013，Tomasina et al.，2013），该设备通常用于组织培养监测和分析，但其特性也可有利地用于微生物生物膜的研究，微生物生物膜通常在载体上形成异质结构，单个显微镜图像无法提供完全客观的视图。据我们所知，Cellavista从未用于酵母细胞粘附的量化，也从未用于研究添加抗生素和其他具有抗生物膜活性的生物活性天然物质对生物膜形成不同阶段的调节作用。Sirmerova et al.（2013）的唯一相关研究描述了使用荧光应用的Cellavista藻类生物膜对表面的污染。
使用Cellavista自动显微镜和图像分析软件为固定细胞的鉴定和量化带来了新的可能性，同时也为生物膜的整体表征带来了新的可能性。在我们的研究中，通过brightfield应用探索两性霉素B、黄芩素和壳聚糖对酵母生物膜形成的抗真菌/抗生物膜活性，记录了这一特征。对于荧光应用，需要40×物镜，因此培养容器的底部厚度不应超过约150–200μm。这需要专门的培养容器，最好是为显微镜指定厚度均匀的玻璃底部。因此，对于高通量筛选，我们建议在这项工作中使用brightfield应用和标准微孔板。我们的方法将其应用潜力扩展到微生物领域，并允许轻松监测生物膜的形成和快速筛选生物活性化合物的效果。
综上所述，我们已经证明黄芩素和壳聚糖是天然物质，能够抑制微生物粘附到表面或破坏准硅藻土链球菌和克鲁西链球菌预先形成的生物膜。另一方面，两性霉素B（通常使用真菌抗生素）促进了副硅藻酸杆菌的生物膜形成，而不是将其根除。因此，Cellavista自动显微镜是一种出色的设备，显着提高了实验工作的效率，提供了与之前公布的程序完全可比的结果，如上所述，可以更全面地观察生物膜。
虽然黄芩素在高浓度下表现出抗菌活性，但其抗生物膜活性在低10倍左右的浓度下观察到。这是一个相当重要的发现，因为之前描述的大多数物质在较高浓度下对生物膜的作用通常比对悬浮细胞的最低抑制浓度更有效。我们认为，黄芩素和壳聚糖可用于破坏医疗设备上的微生物生物膜，也可用于治疗各种与生物膜相关的感染。感谢特定大学研究（MSMT第20/2015号）和GACR拨款14-23597S提供的财政支持。