3讨论
3.1嗜碱盐单胞菌的生长特性与应用潜力
嗜碱盐单胞菌(H.alkaliphila)适宜栖息于高盐碱生境(pH 7.5−13.0，10%−20%NaCl)，可利用葡萄糖、甘露醇和蔗糖等碳源的嗜碱、耐盐革兰阴性细菌[21]，广泛分布于盐碱湖和海洋生境。嗜碱盐单胞菌被广泛应用于生产次级代谢物和进化污染水源，具有良好的应用研究前景[21]。如Romano等[21]从意大利盐碱湖Campania Region中分离一株嗜碱耐盐菌株H.alkaliphila 18bAG，该菌株可合成PHB和胞外多聚物(extracellular polymeric substances,EPS)；Berlanga等[22]从盐碱湖Ebro Delta中分离到一株H.alkaliphila MAT16，该菌株可以合成聚羟基脂肪酸酯(poly-hydroxyalkanoates,PHA)；Ren等[23]从海水中分离获得一株嗜碱耐盐菌株H.alkaliphila HRL-9，该菌株具有脱氮反硝化能力。本研究共计分离10株5种盐单胞菌，如H.alkaliphila、H.venusta、H.chromatireducens、H.hydrothermalis和H.campaniensis，其中H.alkaliphila占比最高(4株，丰度占比40%)。分离获得的H.alkaliphila菌株大多数具有较强的耐盐碱特性，耐受盐度0.0−3.0 mol/L，pH 8.0−13.0，这可能由于扎布耶湖湖水碳酸盐浓度饱和且pH高所致。此外，相较于其他菌株，H.alkaliphila ZB109胞内ectoine积聚量较高(优化前303.62 mg/L)，发酵条件优化后可达696.313 mg/L，可能成为ectoine生物合成的资源菌种，具有潜在的应用价值。
3.2影响盐单胞菌胞内ectoine积聚量的因素分析
盐单胞菌通过胞内积累具有高度水溶性的有机化合物(ectoine或羟基四氢嘧啶)以应对极端盐碱环境胁迫，表现为菌株生长量(OD600)和ectoine积聚量先增加后降低[24-25]。如周月慧等[26]对菌株H.venusta SL21研究发现，当培养基中NaCl浓度为2.0 mol/L时，ectoine合成量最高为272.8 mg/L，当NaCl浓度超过2.5 mol/L时，ectoine合成量减少；王慧敏等[27]对菌株Halomonas sp.Y研究发现，随着培养基中NaCl浓度增加，菌株胞内合成ectoine的积聚量先增后减，最佳NaCl浓度为150 g/L，ectoine合成量可达246.6 mg/L；王魁荣等[28]对菌株Halomonas sp.NY-011研究发现，当NaCl浓度达到120 g/L时，菌株胞内ectoine的积聚量可达71.5 mg/g，当NaCl浓度大于150 g/L时，菌株NY-011基本停止生长。这些报道与本研究的结果相似，即菌株ZB109的生长量与胞内ectoine积聚量随着盐度的增加，呈现先增后降的趋势。这可能由于盐胁迫促进菌株ZB109胞内ectoine合成相关基因表达量增加，而盐浓度较高时，菌株ZB109菌体生长受抑制。此外，Plackett-Burman和Box-Behnken试验显示，NaCl浓度是影响菌株ZB109胞内ectoine积聚量的最主要因素(P值分别为0.000 2和0.003 5)。
为提高菌株胞内ectoine的积聚量，通常在盐单胞菌发酵过程中添加天冬氨酸和谷氨酸等中间代谢物或前体底物。如沈国平等[29]对菌株H.campaniensis XH26研究发现，随着培养基中MSG浓度增加，菌株胞内合成ectoine的积聚量先增后减，当MSG浓度为30 mmol/L时，ectoine的积聚量达到最大值321.83 mg/L；刘静[30]对菌株Halomonas sp.X26研究发现，培养基中MSG为0.035 mol/L时，胞内ectoine积聚量为491.19 mg/L。本研究Plackett-Burman和Box-Behnken试验显示，MSG是影响菌株ZB109胞内ectoine积聚量的次要因素(P值分别为0.022 0和0.025 4)。通过单因素试验发现，随着MSG浓度的增加，菌株ZB109的生长量(OD600)与胞内ectoine积聚量呈现先增后降的趋势，这可能由于MSG浓度升高的同时，增加了培养基中Na+浓度，从而抑制菌株ZB109的生长。此外，文献综合显示pH值也是影响盐单胞菌胞内ectoine的积聚量的因素之一。如朱德锐等[9]对菌株H.ventosae QHL5研究发现，当pH 8.0时，菌株ectoine干重比最大，当pH>9.5后，菌株生长量明显下降。本研究中菌株ZB109在pH 10.0时生长量最大，但是单因素试验显示，pH对菌株ZB109胞内ectoine积聚量影响的规律性不显著，这可能由于ectoine发酵培养基中存在大量Mg2+和Ca2+，高pH条件下，Mg2+和Ca2+被消耗所致。后续研究将基于转录组学和蛋白组学深入探究NaCl、MSG浓度和pH影响菌株ZB109的胞内ectoine积聚量的机制，为进一步提高盐单胞菌ectoine积聚量提供一定的理论依据。
3.3响应面法提高菌株胞内ectoine积聚量的应用前景
响应面法基于综合试验设计和数学建模，是目前优化培养基的主流实验方法之一[31]。文献综合显示，响应面法广泛应用于提高菌株胞内ectoine积聚量，是分析影响ectoine积聚量关键因素的重要手段。如Kushwaha等[32]通过Box-Behnken和响应面法优化培养基成分，当培养基盐度达到15%时，菌株Halomonas sp.SBS10胞内ectoine积聚量可达617 g/g；Omara等[33]通过Plackett-Burman和Box-Behnken优化培养基成分，结果表明在最适组合下(培养时间78 h、pH 7.5和盐度8%)，Vibrio sp.CS1和Salinivibrio costicola SH3胞内ectoine积聚量分别可达477 mg/L和215 mg/L；汪明香等[15]通过Plackett-Burman和Box-Behnken优化培养基成分，结果表明在最适组合下(0.05 g/L磁性纳米金属颗粒Fe3O4NPs、1.53 mol/L NaCl和0.03 mol/L MSG)，H.campaniensis XH26胞内ectoine积聚量可达640.28 mg/L。本研究以NaCl浓度、Mg2+浓度、Ca2+浓度、MSG浓度和CaCO3浓度为单因素，菌株ZB109胞内ectoine积聚量为响应值，通过Plackett-Burman筛选出关键因素是NaCl浓度、Mg2+浓度和MSG浓度，并通过Box-Behnken明确最优培养基组分(NaCl 1.25 mol/L；Mg2+0.09 mol/L，MSG 0.08 mol/L)。使用优化培养基37℃、180 r/min振荡培养48 h后，菌株ZB109胞内ectoine积聚量可达696.313 mg/L，较优化前(303.62 mg/L)提高了392.693 mg/L(129.34%)。综上，在提高菌株胞内四氢嘧啶积聚量方面，响应面法具有良好的方法学应用前景，后续研究将甄选不同类型的碳氮源分析菌株ZB109胞内ectoine积聚量的变化，为进一步优化菌株ZB109发酵培养基提供一定的参考依据。
4结论
利用Horikoshi-Ⅰ培养基分离获得盐单胞菌合计10株，分属6个种，优势种是嗜碱盐单胞菌(4株，丰度占比40%)，分离菌株均属于极端嗜碱盐菌。生理生化试验显示，菌株ZB109可利用的碳氮源宽泛(如KNO3、葡萄糖和蔗糖等)，盐碱耐受范围较大(最佳生长盐度范围0.5−2.5 mol/L，最佳生长pH 8.0−10.0)，胞内ectoine积聚量较高(优化前303.62 mg/L)，具有生产四氢嘧啶类化合物的潜力。通过Plackett-Burman、Box-Behnken试验和响应面法，明确NaCl、Mg2+和MSG是影响菌株ZB109胞内ectoine积聚量的关键因素。在此基础上对ectoine发酵培养基进行优化，优化后培养基的NaCl和MSG的浓度分别提高至72.5和15.4 g/L，MgSO4·7H2O浓度降低至22.2 g/L，胞内ectoine积聚量可达696.313 mg/L，提高了392.693 mg/L，为ectoine的生物合成积累了潜在菌种资源。
嗜碱盐单胞菌菌株生理生化与生长特性、最优发酵条件——摘要、材料与方法
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