考虑到未经处理和PL处理的枯草杆菌孢子的萌发和随后的营养生长，通过修改两种处理之间的时间来评估亚致死通量（0.5 J/cm2）诱导的热敏感性的持续性。为此，将枯草杆菌孢子悬浮在水或营养肉汤（TSB）中，并在4或30°C下储存不同时间，然后再进行热处理。
图4。 亚致死PL预处理（0.5 J/cm2）后枯草杆菌孢子的热敏性（90°C，10分钟） )在30°C（填充符号）或4°C（空符号）下存储期间 在蒸馏水（a）或营养培养基（TSB）（b）中：孢子PL预处理，但不接受后期热处理（PL预处理对照）( ■), 孢子孵化和 进行热处理，但之前未进行PL预处理（热处理 控制）( ▲) 孢子PL经过预处理和后热处理 ( ●). 误差线表示95%水平的置信区间。 连续线显示 枚举检测级别。
在水中储存24小时不会影响经过预先PL处理（0.5 J/cm2）的枯草杆菌孢子的可培养性，也不会影响未处理孢子（未经PL预处理）的加热敏感性（90°C，10分钟）（图4a）。B、亚致死光致发光预处理（0.5 J/cm2）后，枯草杆菌孢子在4或30°C的水中保存至少24小时，保持增强的热敏性（与两种处理的单独效应之和相比，额外减少0.7 Log）。因为发现先前光致发光预处理诱导的热敏性与处理之间经过的时间无关，暴露于PL对枯草杆菌孢子造成的损害可能是不可逆的。
通过在热处理之前将枯草杆菌孢子放置在TSB（4或30°C）中不同时间，也评估了亚致死PL预处理（0.5 J/cm2）诱导的热敏感性的持续性。暴露于0.5 J/cm2的通量（未经热处理）不会影响枯草杆菌在30°C下培养期间的可培养性，并且在PL处理后至少24小时存活细胞数保持恒定（约108个细胞/毫升）（图4b）。当对枯草杆菌孢子进行热处理时，未经处理和PL预处理的枯草杆菌细胞在30°C下培养期间的耐热性降低。然而，在1小时之前，未发现热敏性显着增加。在此期间，培养物的光密度降低到初始值的约50–60%（图3），这与孢子从亮相到暗相的变化有关。枯草芽孢杆菌细胞（未经处理和PL处理的细胞）在30°C下培养1至3小时后，对热处理的耐受性显着降低。细菌孢子在此期间萌发，这通过相差显微镜进行了验证。正如其他研究所表明的那样（Nicholson等人，2000年；Setlow，2006年），营养细胞对热处理的抵抗力不如孢子。从3小时到24小时，枯草杆菌细胞的敏感性没有显着增加。
之前指出的协同效应，即先前光致发光处理引起的热敏性增强，一直保持到潜伏期结束（24小时）。当在加热之前应用光致发光预处理时，发现热处理（无光致发光预处理）诱导的细胞失活额外减少1.5对数。关于在4°C下的储存，在储存期间观察到未处理和PL处理的孢子的耐热性略有下降（图4b）。4°C下的耐热性损失低于30°C下的耐热性损失。这一事实可能归因于冷藏降低了芽孢杆菌孢子萌发的事实（Markland等人，2013年）。
如前所述，暴露在0.5 J/cm2的通量下不会影响孢子萌发率（图3）。因此，可以排除亚致死光致发光处理（0.5 J/cm2）可能激活休眠孢子并促进萌发，这将导致快速丧失耐热性，如双重热处理（Lovdal等人，2011）或高压处理后再进行相对温和的热处理所示（Melt，1998；Vercammen等人，2012）。
3.3.热处理后PL处理对枯草杆菌孢子失活的影响
在确定PL预处理对枯草芽孢杆菌孢子对后续加热的抗性的影响后，研究了热处理作为PL施用前的预处理的效果。图5显示了在单独PL（0.4或0.5 J/cm2）、热处理（90°C 5、10、15或20分钟）或加热后进行PL处理的枯草杆菌孢子的可培养性。
图5。PL处理（0.4或0.5 J/cm2）对热预处理（90°C：5、10、15或20分钟）后枯草杆菌孢子数的影响。误差线表示95%水平的置信区间。
在90°C下加热5或10分钟（不进行PL后处理）会导致枯草杆菌孢子轻微失活（处理5和10分钟的对数分别减少0.3和0.6）。如前所述，枯草芽孢杆菌的热预处理提高了后续PL处理的抗菌作用。即使在0.4 J/cm2的注量下发现枯草杆菌孢子对随后的光致发光处理有热致敏作用，但在0.5 J/cm2的注量下更为明显。事实上，在90°C下加热5分钟，然后暴露在0.4 J/cm2的通量下，导致枯草杆菌计数减少1.8对数，而在0.5 J/cm2的通量下观察到4对数减少。此外，当热预处理时间较长时，PL诱导枯草芽孢杆菌数量减少。在90°C下加热5分钟后，0.4 J/cm2的注量导致1.8对数减少，而在90分钟下加热10分钟、15分钟和20分钟后，枯草杆菌计数分别减少2.1、3.7和5.7对数。PL和热处理的组合可以使用比单独使用热时孢子失活所需的温度更低或处理时间更少的温度。这样，在90°C下加热20分钟导致枯草芽孢杆菌计数减少约2对数，而当PL处理（0.4 J/cm2）之前进行较弱的热处理（90°C下仅5分钟）时，发现类似的减少。
在所有情况下，观察到两种技术（热处理和PL）之间对微生物失活的协同作用与其各自作用的总和相比（图5）。这些结果与早期关于紫外线的研究一致，该研究报告称，在热处理后存活的大肠杆菌细胞对随后的紫外线辐射更为敏感（Okuda，1974）。当紫外线处理之前进行加热预处理时，也发现灰葡萄孢分生孢子的协同失活（Marquenie等人，2002）。相比之下，最近发表的一项研究表明，之前在60°C下处理3.58分钟不会使凝结芽孢杆菌对随后的紫外线处理敏感（Gayán等人，2013）。然而，热处理的温度低于本研究中使用的温度，可能不足以提高孢子对后续紫外线处理的敏感性。
处理的顺序似乎对枯草杆菌孢子的失活有重大影响。在灭活枯草杆菌孢子方面，先加热后PL的顺序最有效。当孢子先前暴露于90°C下10分钟时，在0.5 J/cm2的通量下，孢子对数减少了4次以上（图5），而当应用相反顺序时，观察到2.4次对数减少（图2）。加热和光照相结合所观察到的更大的协同效应可能是因为热处理可以触发孢子萌发，这将对光照敏感，而光照预处理不会诱导孢子萌发。另一方面，与PL处理相比，热处理可能导致更多的亚致死损伤，导致对后续处理的敏感性增加。同样，以前也有报道称，其他技术的微生物失活程度取决于应用治疗的顺序（Gayán等人，2013；Marquenie等人，2002；Palgan等人，2012；）。
由于枯草杆菌孢子的微生物膜可能会被光致发光破坏（Wekhof等人，2001），光致发光敏感性的增加可能是由于热引起的细胞膜结构的额外变化（热预处理）。此外，正如之前在UV处理中所证明的（Okuda，1974），热处理可以抑制修复机制，防止PL诱导的损伤得到修复。
3.4.在30°C或4°C下储存期间热预处理后枯草杆菌孢子对PL处理的敏感性
通过监测细胞悬浮液的OD600来评估经过热预处理（90°C，10分钟）的枯草杆菌孢子的萌发和随后的营养生长。当枯草芽孢杆菌孢子悬浮在水中（无营养物质）时，未检测到孢子萌发，未经处理和PL处理的样品之间没有差异（图6）。在营养肉汤中培养表明，未经处理和热预处理的孢子的OD600类似下降，这表明在90°C下加热10分钟对孢子萌发率没有实质性影响。另一方面，未经处理的孢子在孵育1小时后开始指数生长阶段，而对于经过先前热处理的孢子悬浮液，在3小时前未观察到OD600增加。为了评估热预处理诱导的敏感性增强的持续性，在萌发和生长过程的不同阶段对枯草杆菌孢子进行PL处理。
图6。枯草芽孢杆菌孢子萌发和营养生长的比较：TSB中未经处理的孢子（对照）(▬),孢子在90°C的水热处理中暴露10分钟，然后在TSB中孵化（–），未经处理的孢子或孢子在90°C的水热处理中暴露10分钟，然后在水中孵化（–）。在30°C下，通过OD600的变化测量发芽和营养生长。
图7。在蒸馏水（a）或营养介质（TSB）中以30°C（填充符号）或4°C（空符号）储存期间，热预处理（90°C，10分钟）后枯草杆菌孢子对PL处理（0.5 J/cm2）的敏感性（B）：在没有先前热处理的情况下孵化并进行PL处理的孢子（PL处理对照）(■),经热预处理但未经后PL处理的孢子（热预处理对照）(▲)对孢子进行热预处理，并对其进行0.5J/cm2的后PL处理(●).误差线表示95%水平的置信区间。连续线显示检测级别。
图7显示了未经处理和热处理的孢子对PL处理的存活率，这些孢子在受到PL处理之前存储了不同的时间。如前所示，在水中存储24小时不会影响未经处理的孢子（未经热预处理）对PL的敏感性或枯草芽孢杆菌孢子在90°C下10分钟的可培养性（图7a）。此外，经热预处理的枯草芽孢杆菌孢子在4或30°C下保存至少24小时后仍对PL敏感。
在PL处理之前，将枯草芽孢杆菌孢子放置在TSB（4或30°C）中不同时间，以评估增强的PL敏感性的持续性。未经处理和热预处理的孢子在30°C孵育期间对PL处理的抵抗力均下降（图7b）。在孵化的最初几个小时（1-3小时）内，这种对PL处理的耐药性丧失是明显的，而枯草杆菌细胞对PL的敏感性在孵化后（长达24小时）没有增加。尽管孢子萌发开始于1小时之前，如OD600下降所示（图6），枯草芽孢杆菌细胞在萌发过程结束前仍保持其抗性。根据之前的研究表明，孢子对PL处理的抵抗力比营养种群大得多（Dunn等人，1989年；Levy等人，2012年），枯草芽孢杆菌孢子在3小时后萌发。萌发后，细胞在6到24小时内对热处理同样敏感。此外，热预处理的枯草杆菌细胞在30°C的TSB中储存期间至少24小时对PL保持敏化（图7b）。在4°C下，经过热预处理后，枯草杆菌孢子仍然对PL敏感。然而，在该贮藏温度下，在TSB中培养期间，观察到对后续PL处理的耐受性略有下降。由于使用相衬显微镜进行了验证，制冷条件不足以有利于完成孢子萌发。
3.5.枯草芽孢杆菌孢子在30°C或4°C贮藏期间经PL预处理后对PL处理的敏感性
在确定光致发光和热处理的联合效应后，在萌发和生长过程的不同阶段评估亚致死光致发光处理（0.5 J/cm2）对枯草杆菌孢子对第二次光致发光处理（0.5 J/cm2）的抗性的影响。在30°C和4°C的条件下，在水中储存24小时，不会影响双PL处理的有效性，无论处理之间经过多长时间，都观察到类似程度的孢子失活（图8a）。
图8。枯草芽孢杆菌孢子在蒸馏水（a）或营养介质（TSB）中30°C（填充符号）或4°C（空符号）储存期间，经过亚致死PL预处理（0.5 J/cm2）后对PL处理（0.5 J/cm2）的敏感性（B）：孢子PL预处理，但未进行后PL处理（PL预处理对照）(■),在未进行PL处理的情况下孵化并进行PL处理的孢子（PL处理对照）(▲)孢子PL预处理后再进行0.5J/cm2的PL处理(●).误差线表示95%水平的置信区间。连续线显示检测级别。
当枯草芽孢杆菌孢子被放置在诱导孢子萌发（TSB）的营养肉汤中时，在30°C下孵化期间发现对PL的敏感性增加（图8b）。枯草芽孢杆菌细胞的这种耐药性丧失在孵化的前几个小时（1-3小时）尤为明显，而在孵化后（直到24小时），对PL的敏感性没有显着增加。虽然枯草芽孢杆菌孢子在1小时之前开始萌发过程（图4），但直到萌发过程的最后阶段，它们才完全失去对PL的抗性，在3到24小时内同样敏感。
此外，当枯草杆菌孢子接受亚致死PL预处理时，与每个PL处理的个体效应相比，观察到对PL更敏感（图8b）。PL处理之间在30°C下储存24小时后，枯草杆菌6的细胞数减少了5.5 Log。然而，未经处理的孢子的单独PL处理或未经第二次PL处理的PL预处理分别导致枯草杆菌计数减少2.5和1 Log。因此，先前暴露于亚致死剂量使枯草杆菌孢子对第二次PL处理敏感。亚致死通量引起的敏感性增强可能是由于修复机制受到抑制或亚致死损伤的存在，这将使枯草杆菌孢子更容易受到第二种PL。
本研究的结果清楚地表明，暴露于亚致死处理会使枯草杆菌孢子对后续处理敏感。这种增强的灵敏度在4或30°C的水中保存至少24小时（即以孢子形式保持灵敏度）。此外，在亚致死处理下存活的枯草杆菌孢子在孢子萌发后仍然对后续处理敏感。在减少枯草芽孢杆菌数量方面，加热后的PL是最有效的组合。虽然需要进一步研究以阐明热和光协同作用的机制，但这些处理组合似乎是传统方法的一种有希望的替代方法，以确保微生物安全，同时不损害食品质量。
致谢
巴斯克政府环境、领土规划、农业和渔业部为这项工作提供了支持。M、L.Artíguez由巴斯克政府教育、大学和研究部的博士资助。