1、材料与方法


1.1材料


1.1.1试验菌株大肠杆菌BL21(DE3)/pET15b-Tres(本实验室构建菌种)。


1.1.2培养基LB液体培养基(%):酵母浸粉0.5,蛋白胨1.0,NaCl 1.0。


M9乳糖诱导培养基(%):Na2HPO4·12H2O 1.72,KH2PO40.3,NaCl 0.05,NH4Cl 0.1,MgSO40.05,CaCl20.001,乳糖0.5。


β-半乳糖苷酶反应缓冲液(%):NaCl 0.8,KCl 0.02,Na2HPO4·12H2O 0.29,KH2PO40.024,MgSO4·7H2O 0.025,β-巯基乙醇0.39。


氨苄青霉素(Amp):50 mL无菌水中加入0.5 g氨苄西林钠(0.5 g/瓶)。


其他试剂均为分析纯。


1.1.3仪器振荡培养箱;立式自动电热压力蒸汽灭菌锅;标准型净化工作台;电子天平;隔水式恒温培养箱;往复式水浴恒温振荡器;DDS-11A电导率仪;紫外可见分光光度计;全自动微生物生长分析仪;ChampGel5 500生物电泳凝胶成像分析系统;F-4500荧光分光光度计;5804R高速冷冻离心机。


1.2方法


1.2.1菌种的活化培养配制

LB液体培养基经121℃灭菌20 min后,冷却,于培养基中加入Amp(终浓度为100 mg/L)后接菌,37℃、180 r/min的条件下培养24 h。取菌液在加有Amp的固体培养基上进行划线培养,挑取生长状况较好的单个菌落进行液体培养基扩增。


1.2.2对生长曲线的影响

取活化后的大肠杆菌BL21(DE3)/pET15b-TreS按1%的接种量分别接种于9个100 mL加有Amp的LB培养基中,加入灭菌的乙酸钠溶液,使其终浓度分别为0、0.5、1、2、4、5、10、20和30 g/L,于37℃、180 r/min的条件下培养,并在不同的时间点取样测OD值,绘制生长曲线。


1.2.3对细胞显微特征的影响

将培养至对数生长期的重组菌于5 000 r/min,4℃条件下离心10 min,弃上清,收集菌体,用无菌生理盐水洗涤3次,并稀释至菌体浓度约为107CFU/mL。


取制备的重组菌菌悬液20 mL,分别加入乙酸(使其终浓度分别为6.25 g/L和25 g/L)、乙酸钠溶液(使其终浓度分别为6.72 g/L和26.88 g/L),同时设置无菌生理盐水对照组,37℃孵育2 h。将对照组和试验组的重组菌菌液离心收集菌体,洗涤后用2.5%的戊二醛于4℃条件下固定2 h后涂片,使样品自然风干。制备的样品用环境扫描电子显微镜观察重组菌形态的变化情况。


1.2.4对菌体细胞膜通透性的影响

将培养至对数期的重组菌菌体,用无菌水稀释至菌液浓度为107CFU/mL,取稀释后的菌液27 mL,加入3 mL抑菌成分,分别为乙酸(终浓度分别为:3.125、6.25、12.5和25 g/L)、乙酸钠(终浓度分别为:3.36、6.72、13.44和26.88 g/L),同时设置无菌水对照组,置于37℃恒温水浴振荡器中,然后分别在0、10、20、30、40、50和180 min时测定其电导率值。


1.2.5对菌体细胞膜完整性的影响

将培养至对数期的重组菌菌体,用生理盐水稀释至菌体浓度为107CFU/mL左右,取稀释后的菌液45 mL,加入5 mL不同浓度的抑菌成分,分别为乙酸(终浓度分别为:3.125、6.25、12.5和25 g/L)、乙酸钠(终浓度分别为:3.36、6.72、13.44和26.88 g/L),并设置空白对照组,然后置于37℃恒温水浴振荡器中,分别在不同时间点取样,并在6 000 r/min的条件下,离心5 min,取上清用紫外分光光度计测其在260 nm处的吸光值。


1.2.6对细胞内膜的渗透性影响

培养重组菌至对数生长期,取菌液10 mL进行离心,菌体用无菌生理盐水洗涤两次,转移至100 mL的M9乳糖诱导培养基中,于37℃恒温振荡培养10 h,然后离心,收集菌体,用β-半乳糖苷酶反应缓冲液重悬至OD600为0.2左右。


取9 mL反应缓冲液重悬的菌液,分别加入1 mL不同浓度的乙酸钠(终浓度分别为:3.36、6.72、13.44和26.88 g/L)混匀,37℃孵育2 h后离心菌体,取上清4.5 mL,再加入500μL 1 mg/mL的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG),置于37℃恒温水浴中,孵育2 h后,于420 nm的波长下测其吸光值。


1.2.7荧光分析法测乙酸对菌体膜蛋白构象的影响

将重组菌培养至对数生长期,离心、洗涤菌体,用生理盐水重悬,浓度约为107CFU/mL,分别在5 mL灭菌的EP管中加入1 mL的菌悬液,然后加入1 mL不同浓度的冰乙酸(乙酸的终浓度依次为0、3.125、6.25、12.5和25 g/L),于37℃恒温水浴锅中保温1h后,置于日立F-4500荧光分光光度计上进行检测。


1.2.8对蛋白质合成的影响将重组菌培养至对数生长期,按1%接种量分别接种于100 mL加Amp的LB液体培养基中,同时分别加入0.1 g/L灭菌的乙酸钠溶液,使得乙酸钠的终浓度分别为0.5、1、2、3、4和5 g/L,并设置对照组,培养8 h后,加入乳糖诱导,诱导12 h后,收集菌体,并进行洗涤,将洗涤后的菌体用pH7.4的磷酸缓冲液悬浮至吸光值相同,经超声破碎后离心取上清,进行SDS-PAGE。配制浓度为5%的浓缩胶和浓度为12%的分离胶进行蛋白电泳,取上清液样品20μL与20μL上样缓冲液混合,于沸水中煮沸10 min后,进行点样。


高密度发酵的过程中乙酸抑制重组大肠杆菌生长及外源基因的表达——摘要

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