1、材料与方法
1.1材料
1.1.1试验菌株大肠杆菌BL21（DE3）/pET15b-Tres（本实验室构建菌种）。
1.1.2培养基LB液体培养基（%）：酵母浸粉0.5，蛋白胨1.0，NaCl 1.0。
M9乳糖诱导培养基（%）：Na2HPO4·12H2O 1.72，KH2PO40.3，NaCl 0.05，NH4Cl 0.1，MgSO40.05，CaCl20.001，乳糖0.5。
β-半乳糖苷酶反应缓冲液（%）：NaCl 0.8，KCl 0.02，Na2HPO4·12H2O 0.29，KH2PO40.024，MgSO4·7H2O 0.025，β-巯基乙醇0.39。
氨苄青霉素（Amp）：50 mL无菌水中加入0.5 g氨苄西林钠（0.5 g/瓶）。
其他试剂均为分析纯。
1.1.3仪器振荡培养箱；立式自动电热压力蒸汽灭菌锅；标准型净化工作台；电子天平；隔水式恒温培养箱；往复式水浴恒温振荡器；DDS-11A电导率仪；紫外可见分光光度计；全自动微生物生长分析仪；ChampGel5 500生物电泳凝胶成像分析系统；F-4500荧光分光光度计；5804R高速冷冻离心机。
1.2方法
1.2.1菌种的活化培养配制
LB液体培养基经121℃灭菌20 min后，冷却，于培养基中加入Amp（终浓度为100 mg/L）后接菌，37℃、180 r/min的条件下培养24 h。取菌液在加有Amp的固体培养基上进行划线培养，挑取生长状况较好的单个菌落进行液体培养基扩增。
1.2.2对生长曲线的影响
取活化后的大肠杆菌BL21（DE3）/pET15b-TreS按1%的接种量分别接种于9个100 mL加有Amp的LB培养基中，加入灭菌的乙酸钠溶液，使其终浓度分别为0、0.5、1、2、4、5、10、20和30 g/L，于37℃、180 r/min的条件下培养，并在不同的时间点取样测OD值，绘制生长曲线。
1.2.3对细胞显微特征的影响
将培养至对数生长期的重组菌于5 000 r/min，4℃条件下离心10 min，弃上清，收集菌体，用无菌生理盐水洗涤3次，并稀释至菌体浓度约为107CFU/mL。
取制备的重组菌菌悬液20 mL，分别加入乙酸（使其终浓度分别为6.25 g/L和25 g/L）、乙酸钠溶液（使其终浓度分别为6.72 g/L和26.88 g/L），同时设置无菌生理盐水对照组，37℃孵育2 h。将对照组和试验组的重组菌菌液离心收集菌体，洗涤后用2.5%的戊二醛于4℃条件下固定2 h后涂片，使样品自然风干。制备的样品用环境扫描电子显微镜观察重组菌形态的变化情况。
1.2.4对菌体细胞膜通透性的影响
将培养至对数期的重组菌菌体，用无菌水稀释至菌液浓度为107CFU/mL，取稀释后的菌液27 mL，加入3 mL抑菌成分，分别为乙酸（终浓度分别为：3.125、6.25、12.5和25 g/L）、乙酸钠（终浓度分别为：3.36、6.72、13.44和26.88 g/L），同时设置无菌水对照组，置于37℃恒温水浴振荡器中，然后分别在0、10、20、30、40、50和180 min时测定其电导率值。
1.2.5对菌体细胞膜完整性的影响
将培养至对数期的重组菌菌体，用生理盐水稀释至菌体浓度为107CFU/mL左右，取稀释后的菌液45 mL，加入5 mL不同浓度的抑菌成分，分别为乙酸（终浓度分别为：3.125、6.25、12.5和25 g/L）、乙酸钠（终浓度分别为：3.36、6.72、13.44和26.88 g/L），并设置空白对照组，然后置于37℃恒温水浴振荡器中，分别在不同时间点取样，并在6 000 r/min的条件下，离心5 min，取上清用紫外分光光度计测其在260 nm处的吸光值。
1.2.6对细胞内膜的渗透性影响
培养重组菌至对数生长期，取菌液10 mL进行离心，菌体用无菌生理盐水洗涤两次，转移至100 mL的M9乳糖诱导培养基中，于37℃恒温振荡培养10 h，然后离心，收集菌体，用β-半乳糖苷酶反应缓冲液重悬至OD600为0.2左右。
取9 mL反应缓冲液重悬的菌液，分别加入1 mL不同浓度的乙酸钠（终浓度分别为：3.36、6.72、13.44和26.88 g/L）混匀，37℃孵育2 h后离心菌体，取上清4.5 mL，再加入500μL 1 mg/mL的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG），置于37℃恒温水浴中，孵育2 h后，于420 nm的波长下测其吸光值。
1.2.7荧光分析法测乙酸对菌体膜蛋白构象的影响
将重组菌培养至对数生长期，离心、洗涤菌体，用生理盐水重悬，浓度约为107CFU/mL，分别在5 mL灭菌的EP管中加入1 mL的菌悬液，然后加入1 mL不同浓度的冰乙酸（乙酸的终浓度依次为0、3.125、6.25、12.5和25 g/L），于37℃恒温水浴锅中保温1h后，置于日立F-4500荧光分光光度计上进行检测。
1.2.8对蛋白质合成的影响将重组菌培养至对数生长期，按1%接种量分别接种于100 mL加Amp的LB液体培养基中，同时分别加入0.1 g/L灭菌的乙酸钠溶液，使得乙酸钠的终浓度分别为0.5、1、2、3、4和5 g/L，并设置对照组，培养8 h后，加入乳糖诱导，诱导12 h后，收集菌体，并进行洗涤，将洗涤后的菌体用pH7.4的磷酸缓冲液悬浮至吸光值相同，经超声破碎后离心取上清，进行SDS-PAGE。配制浓度为5%的浓缩胶和浓度为12%的分离胶进行蛋白电泳，取上清液样品20μL与20μL上样缓冲液混合，于沸水中煮沸10 min后，进行点样。
高密度发酵的过程中乙酸抑制重组大肠杆菌生长及外源基因的表达——摘要
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