果胶杆菌(P.carotovorumsubsp.carotovorum)是一种危害广泛的植物病原菌，能够侵染白菜类蔬菜、马铃薯、胡萝卜、洋葱、辣椒、大蒜、人参、君子兰、魔芋、郁金香、马蹄莲等植物，破坏力强，危害较大。目前，国内外对果胶杆菌的致病机理以及抑制方法研究较少。二氧化氯是国际上公认的最新一代的高效、广谱、安全的杀菌剂和保鲜剂，具有适应面广、使用剂量低、效果好、反应快、无毒、无副作用等优点，但是二氧化氯对果胶杆菌的抑制研究鲜有报道。
果胶酶系和纤维素酶系在植物病原菌侵染的过程中起着关键作用，可以破坏植物的细胞壁结构，分解利用植物细胞和组织内营养成分，引起细胞死亡。本试验采用二氧化氯处理果胶杆菌，研究二氧化氯溶液对果胶杆菌活力以及致病相关酶活性的影响。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试验材料
果胶杆菌(P.carotovorumsubsp.carotovorum)由自然发病的杭白菜软腐病病斑上筛选分离得到，纯化后于4℃保存，备用。
1.1.2试验仪器
分光光度计(752紫外可见分光光度计)、超净工作台、高压灭菌锅、恒温培养箱、全自动微生物曲线分析仪、恒温水浴锅、电子天平等。
1.1.3培养基配方
二氧化氯(食品级)及其他试剂(分析纯)在国药化学试剂有限公司购买。
LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，用蒸馏水定容至1 000mL，灭菌后备用。
LB固体培养基：依照LB液体培养基，每1.0 L再加入15g琼脂，灭菌后备用。
细胞壁降解酶诱导培养基：参照Marcus L等的方法。
1.2试验方法
1.2.1试剂的配制以及标准曲线的制作
(2)取二氧化氯母液和无菌水分别配制浓度为1.01 mgL、4.03 mgL、7.02mgmL的二氧化氯溶液，备用。
还原糖标准曲线的制作：按照表1，分别将试剂加好后摇匀，冷却至室温后定容至25 mL，540nm下测定波长。
表1还原糖标准曲线的制作
半乳糖醛酸标准曲线的制作方法与还原糖标准曲线制作方法相同。
1.2.2二氧化氯溶液对果胶杆菌的处理方法
1.2.2.1果胶杆菌生长曲线的测定
将50个锥形瓶装的LB液体培养基平均分为五组，编码为A、B、C、D、E组(每组10个平行)，分别加入100μL菌悬液，其中A、B、C、D和E五个处理组再分别加入0 mL、1.28 mL、2.63 mL、4.05 mL和5.56 mL的二氧化氯母液，于25℃下振荡培养，2h后取出各组的1号锥形瓶即A1、B1、C1、D1、E1放置于4℃冰箱，随后每隔2h按各组编号从小到大依次取出锥形瓶并放入冰箱，待培养20 h后测定OD值。
1.2.2.2果胶杆菌存活率的测定
将1.2.2.1中培养20 h后的菌悬液分别稀释至原浓度的10-1、10-2、10-3、10-4，吸取10-3、10-4菌悬液100.0μL，涂布平板，静置10min后于恒温培养箱25℃培养36 h，记录平板上的细菌总数，按照公式(1)计算细菌存活率。
存活率=处理组细菌总数/对照组细菌总数*100%(1)
1.2.2.3果胶杆菌细胞膜透性的测定
取培养3d的菌液10mL在4℃下离心，弃去上清液后，用吸水纸吸取菌体表面的水分，各取1g，离心后菌体放入含有0.25mgL、0.5mgL、0.75mgL、1.0mgL四种浓度二氧化氯的锥形瓶中，用电导仪测定溶液电导率记，为C0，然后在100 rmin、25℃震荡培养，分别在0 min、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min测定菌体浸出液的电导率，记为Ct。测完后，将所有三角瓶放置于沸水中煮沸15 min，以杀死菌体细胞，待冷却至25℃后再次测定各电导率值，记为C。根据公式(2)计算相对电导率值(%)，用相对电导率表示菌体细胞膜的通透性。试验重复3次，每个处理设5个平行。
相对电导率=（Ct-Co）/C*100%(2)
式中：C0-0min时测定的的电导率值；Ct-各时间测定的电导率值；C-煮沸后测定的电导率值。
1.2.2.4细胞壁降解酶活力的测定
(1)果胶酶(PG)活力测定
取0.5%果胶1.9mL，50℃的条件下预热10min，加0.1mL酶液，50℃条件下反应30min，加入1.5mL DNS(3,5-二硝基水杨酸，3,5-Dinitrosalicylic acid)，沸水浴5min，定容至25mL，测定540nm下波长。
(2)聚甲基半乳糖醛酸酶(PMG)活力测定
取1%果胶1.5mL，30℃的条件下水浴30 min，加入0.5 mL酶液，在30℃的条件下反应30 min，加入1.5 mL DNS，沸水浴5 min，定容至25 mL，测定540 nm下波长。
(3)甲基纤维素酶(CX)活力的测定
取0.51%羧甲基纤维素(CMC)溶液1.5mL，50℃预热10min后，加入0.5mL酶液，50℃的条件下，反应30min，加入1.5mL DNS，沸水浴5min，定容至25mL，测定540nm下波长。
(4)β-葡萄糖苷酶(GLU)活力测定
1.2.2.5果胶杆菌致病力的测定
取杭白菜叶柄基部切4 cm左右的茎段，75%酒精擦拭消毒，下衬一张无菌滤纸，置于无菌培养皿中，并加入2.0 mL无菌蒸馏水保持湿度。用灭菌小刀在其中心划2 mm×2 mm的十字型伤口，深度为1.5 mm左右，取10μL的经不同浓度二氧化氯气体处理、浓度为105个mL果胶杆菌菌悬液加入十字形伤口处，重复5次。用封口膜将培养皿封口于25℃培养。每隔3 h观察其发病情况，测量病斑长度，每组20个平行处理，并按公式(3)计算发病率。
发病率=调查发病茎段数/调查茎段总数*100% (3)
相关新闻推荐
2、桑椹菌核病拮抗菌的分离筛选、鉴定、生防作用与机理——结果与分析
3、发酵谷物中分离乙醇假丝酵母菌株直接降解白酒中的氨基甲酸乙酯EC