1.2方法
1.2.1 Sprodbtg基因的扩增
通过重叠PCR将SD序列和信号肽ΔS0949序列克隆于proD-BTG基因的N端，获得目的基因。第1轮PCR以质粒pET28a-prodbtg为模板，以P1、R1为引物扩增目的基因；第2轮PCR以第1轮扩增产物为模板，以P2、R1为引物扩增出最终目的基因含SD序列及ΔS0949全长序列的proD-BTG基因。PCR反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃10 min.
1.2.2重组质粒pXMJ19-Sprodbtg的构建
经切胶、回收、纯化后的PCR产物（Sprodbtg基因）及pXMJ19质粒均用HindⅢ和BamHⅠ进行双酶切，分别回收酶切产物，经纯化后，用T4 DNA连接酶于16,℃连接过夜并转化至E.coli JM109，然后涂布于含50µg/mL氯霉素的平板，挑取转化子，提取质粒，酶切验证。将验证正确的重组质粒命名为pXMJ19-Sprodbtg.
1.2.3重组菌株C.glutamicum ATCC13032/pXMJ 19-Sprodbtg的构建
取6µL构建好的质粒pXMJ19-Sprodbtg电转化至C.glutamicum ATCC13032感受态细胞，电击条件同挑取转化子酶切验证，将验证正确的重组菌株命名为C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg.质粒pXMJ19转化子C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19作为对照菌株。
1.2.4重组菌C.glutamicumATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg及C.glutamicumATCC13032/pXMJ 19的诱导表达
分别挑取1环重组菌C.glutamicum ATCC 13032/pXMJ19-Sprodbtg或C.glutamicum ATCC 13032/pXMJ19单菌落，分别接种于装有50,mL LB培养基的250,mL三角瓶中，30℃、200,r/min振荡培养过夜，以1%,的接种量分别转接于装有100 mL MMTG的500 mL三角瓶中，30℃、200 r/min振荡培养12,h，加入终浓度为1,mmol/L的IPTG诱导酶原蛋白proD-BTG的表达，继续培养48 h.分别取1 mL重组菌发酵液于12,000,r/min离心1,min，获取上清液，向其中分别加入130µL 100%,TCA，冰上放置30 min，12,000,r/min离心5,min，弃去上清液，加1,mL丙酮洗涤2次。待丙酮挥发完全后，沉淀分别溶解于20,µL无菌蒸馏水中，各加入5,µL 5×SDS-PAGE电泳上样缓冲液，沸水浴5,min，12,000,r/min离心10,min，分别取上清液进行SDS-PAGE分析。
1.2.5酶原蛋白proD-BTG的酶活力测定
含有酶原蛋白proD-BTG的发酵液通过4,000,r/min离心15,min回收上清液，一定量的Factor Xa加入到表达proD-BTG的重组谷氨酸棒杆菌上清液中切割重组蛋白。随后通过荧光定量分析法分析酶原蛋白proD-BTG的酶活力。
酶活力检测反应体系：90,µL（5,mg/mL）的重组酶和1.98,mL 50,mmol/L Tris-HCl（pH,7.5）包括0.2%,N，N-二甲基酪蛋白，12.5,µmol/L丹磺尸胺（MDC），4.5,mmol/L DTT.反应体系于37,℃反应30,min，加入42,mmol/L（NH4）2SO4终止反应，于激发波长350,nm下检测发射波长500,nm下的荧光强度。
酶活力定义：每分钟催化1 nmol/L的MDC插入到N，N-二甲基酪蛋白所需的酶量定义为1个活力单位（U）。
1.2.6重组菌C.glutamicumATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg诱导条件的优化
重组菌生长曲线的绘制：将培养过夜的菌液按1%,的接种量接入50,mL含有10,µg/mL氯霉素的MMTG培养中，30℃、200 r/min振荡培养，间隔一定时间取样，以MMTG培养基为空白对照，检测培养液600,nm下的吸光度。以该菌种培养时间为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制生长曲线。
最佳诱导时机的确定：分别在接种4、8、12、16、20,h后加入终浓度为1,mmol/L的IPTG开始诱导，30,℃诱导48,h，检测分析诱导时机对proD-BTG表达量的影响。
最佳诱导时间的确定：在最佳诱导时机加入终浓度为1 mmol/L的IPTG开始诱导，30,℃诱导20、30、40、50、60 h，检测分析诱导时机对proD-BTG表达量的变化。
IPTG最佳诱导浓度的确定：在最佳诱导时机加入终浓度分别为0.4、0.6、0.8、1.0、1.2,mmol/L的IPTG开始诱导，30,℃诱导至最佳时间，分析IPTG浓度对proD-BTG表达的影响。
相关新闻推荐
1、新型冠状病毒SARS-CoV2单细胞内增殖特性与传播动力学模型