本研究从尿路感染患者尿液样本中分离、鉴定大肠杆菌裂解性噬菌体，对其裂菌活性等生物学特性进行分析，为探索应用噬菌体治疗耐药性尿路致病性大肠杆菌导致的尿路感染奠定基础。利用双层琼脂平板法，从尿液样品中分离、纯化，得到一株能裂解大肠杆菌的噬菌体。通过电镜观察噬菌体形态，测定其裂菌谱、最佳感染复数、一步生长曲线、以及热稳定性、紫外敏感性和氯仿敏感性等生物学特性。结果显示，成功分离、纯化得到一株能高效裂解大肠杆菌的噬菌体vB_EcoS_JA2，该噬菌体可形成圆形、透明、边缘整齐的噬菌斑；电镜观察噬菌体的头部呈六边形，含可收缩性尾部，尾部较长；一步生长曲线显示，该噬菌体的潜伏期为10 min、爆发期为60 min、裂解量高达124 PFU/Cell，其最佳感染复数为0.1；JA2具有较好的热稳定性，且对紫外线具有一定的抵抗力。分离鉴定的噬菌体JA2能裂解致病性大肠杆菌，具有稳定性好，抵抗力强的特点，为应用噬菌体治疗致病性大肠杆菌导致的尿路感染提供了新材料。
大肠杆菌是医院获得性感染最常见的致病菌，在临床分离鉴定中出现频率仅次于铜绿假单胞菌。该病原主要引起呼吸道感染、泌尿道感染、伤口感染、胆道感染、腹膜炎、败血症和脑膜炎等。尿路致病性大肠杆菌（Uropathogenic，UPEC）是人肾盂肾炎和其他泌尿系感染常见的病原菌，可顽固地存在于膀胱组织中从而引起复发性尿路感染，严重可引起溶血性尿毒综合征，可对患者肾脏造成不可恢复性损伤和患者死亡。近年来的细菌流行病学监测结果表明，大肠杆菌耐药性逐年上升，已成为临床治疗面临的巨大挑战。
噬菌体（Bacteriophage，Phage）是感染细菌的病毒，噬菌体能够靶向裂解宿主菌，也影响宿主菌生物学性状和进化。当前，细菌耐药问题日益突出，临床研究发现噬菌体对多种细菌感染均显示出良好的治疗效果。同时，由于噬菌体具有特异性强、增殖迅速、来源广泛等特点，有望作为一种新的抗菌制剂，成为耐药性细菌抗生素治疗的补充或有效替代。相关研究结果表明，噬菌体治疗可以减少动物体内含菌量，降低病死率，甚至可以彻底治愈病原性细菌感染。但由于噬菌体存在较强的宿主特异性，其裂解效果仅局限于单一或部分菌株，而临床的细菌感染，尤其是尿路感染，其发病通常是由于多种细菌混合感染所致，单一噬菌体的治疗尚不足以达到理想效果。此外，目前噬菌体治疗策略仍存在细菌抗噬菌体突变、治疗时间和剂量、噬菌体制剂安全性及使用条件的问题，同时，随着细菌耐药性问题的加重，使不易导致耐药的噬菌体疗法更受重视，研发筛选出具备高效裂解能力、环境适应性和稳定性良好、基因组上不携带毒力因子且易于分离和纯化的噬菌体剂型的需求极为迫切。为进一步开展噬菌体治疗大肠杆菌感染的研究，本研究对从尿路感染病例患者尿液中分离的大肠杆菌噬菌体的生物学特性进行分析，以期为探索应用噬菌体治疗尿路致病性大肠杆菌感染打下坚实基础。
1材料和方法
1.1材料及菌株
本实验中噬菌体及尿路感染来源细菌均分离自井冈山大学附属医院尿路感染患者尿液标本。大肠杆菌K-12菌株MC1061、MG1655、DM1187及大肠杆菌O157:H7菌株Min27均由上海交通大学严亚贤教授惠赠。大肠杆菌U4372、U4261等菌株（表1）均分离自临床尿路感染病例尿液样品，金黄色葡萄球菌ATCC43300由井冈山大学邓先清副教授惠赠。
1.2主要培养基及试剂
液体LB培养基（g/L）：NaCl 10.0 g，酵母提取物5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，加超纯水定容至1L，1×105Pa、121℃灭菌20 min。半固体LB培养基（上层琼脂）：在液体LB中加入7g/L琼脂粉。固体LB培养基：在液体LB培养基中加入15 g/L的琼脂粉。磷酸盐缓冲液（PBS）：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO41.42 g，KH2PO40.27 g，在烧杯中加入800 mL去离子水，充分搅拌溶解，加去离子水将溶液定容至1L，高温高压灭菌后室温保存。
1.3噬菌体分离与鉴定
将尿液样品通过0.22μm滤膜过滤，所得滤液再依次加入PBS进行10倍倍比稀释，利用双层琼脂平板法，以大肠杆菌K-12菌株MC1061作为指示菌，进行噬菌斑形成实验，检测尿液样品中是否含有裂解性噬菌体。
1.4噬菌体的纯化
在试管加入中5 mL液体LB培养基和200μL大肠杆菌K-12菌株MC 1061，置于摇床37℃、160 r/min振荡培养3～4 h。挑取单个噬菌斑，加入试管中进行扩增培养，利用双层琼脂平板法，进行空斑纯化，直至得到大小一致、形态相同的噬菌斑。
1.5噬菌体电镜观察
采用2%磷钨酸负染法，通过电镜（TEM，Thermo Fisher Talos L120C）观察噬菌体形态。
1.6噬菌体核酸类型鉴定
提取噬菌体基因组，分别用DNase I、RNase A和Mung Bean Nuclease处理噬菌体基因组，37℃消化2 h，将消化产物进行核酸电泳鉴定。
1.7噬菌体的生物学特性分析
对噬菌体裂菌谱，最佳感染复数，一步生长曲线，pH稳定性，对紫外线、氯仿的敏感性，热稳定性等生物学特性进行分析。
1.7.1噬菌体裂菌谱的测定
将500μL待测菌液加入10 mL融化的半固体LB培养基中，混匀后倒入固体LB培养基平板上，待凝固后，在双层琼脂上打孔，加入200μL噬菌体上清液，在37℃条件下过夜培养，观察并测量裂菌圈的大小。
1.7.2噬菌体的最佳感染复数（Multiplicity of Infection，MOI）
分别测定菌液浓度及噬菌体效价，按照感染复数分别为0.001、0.01、0.1、1、10、100的比例将噬菌体与指示菌MC1061混合，培养8 h后过滤，利用双层琼脂平板法分别测定各个比例条件下噬菌体的效价，其中噬菌体效价最高的MOI即为最佳感染复数。
1.7.3噬菌体一步生长曲线测定
按照最佳感染复数MOI比例，将噬菌体与对数生长期的指示菌MC1061菌液混合，置于摇床37℃、160 r/min振荡培养，分别在0、10、20、30、40、50、60、90、120、150 min时间点取样，经滤膜过滤后，通过双层琼脂平板法测定噬菌体的效价，以感染时间为横坐标，以噬菌体效价为纵坐标进而绘制出噬菌体的一步生长曲线。
1.7.4噬菌体热稳定性测定
分别取900μL的液体LB培养基至1.5 mL EP管中，将EP管置于37、40、50、60、70、80℃水浴锅中预热，待液体LB培养基温度稳定后，加入100μL噬菌体上清液，在作用30 min后取出EP管。采用双层琼脂平板法获得各温度条件下的噬菌体效价，从而评价噬菌体的热稳定性。
1.7.5噬菌体对氯仿的敏感性测定
将噬菌体上清液与氯仿按照0、1%、2%、5%的比例进行混合，置于37℃水浴锅中孵育30 min，分别在分层液中各取上层液体100μL，采用双层琼脂平板法进行噬菌体效价测定，评价噬菌体对氯仿的敏感性。
1.7.6噬菌体对紫外线的敏感性测定
取5 mL噬菌体液加入灭菌一次性平皿中，在紫外灯照射下，于0、15、30、45、60、75、90、105、120 min时间点取样，通过双层琼脂平板法，测定噬菌体的效价，进而评估噬菌体的紫外敏感性。
1.7.7 pH稳定性测定
利用NaOH和HCl分别将LB培养基通过pH计对应pH（pH分别为2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14），高压灭菌备用。分别取900μL不同pH值的LB液体培养基至1.5 mL EP管中，各加入100μL噬菌体，并在37℃水浴中孵育1 h，双层琼脂平板法测定处理后的噬菌体效价，评价噬菌体pH稳定性。