微生物的分离是指将目标菌种从微生物群体(尤其是不同微生物群体)中分离出来的技术,是微生物实验最基本的技术。
微生物的分离培养方法主要有三种:划线分离法,涂布平板法和倾注平板法。后两种方法又可以同时进行计数,我们一起详细学习一下微生物分离纯化方法和技巧,微生物数量计数方法,一步步教你学习分离纯化技术,争取从实验室小白进军分离培养大师。
一、划线分离法
1.定义:
利用接种环将目标菌种在固体培养基表面划线,菌种逐步稀释,培养后能够长出许多单一菌落,从而达到菌种分离纯化的目的。
2.目的:
获得纯化的单菌落,越多越好。
3.操作步骤:
(1)取菌种:取出目标菌种,融化后,备用;
(2)接种针灭菌:灼烧接种针进行灭菌;
(3)接种针冷却:将接种针移至酒精灯旁边冷却;
(4)蘸取菌种:甘油管用75%酒精消毒,待酒精挥发完全,在酒精灯火焰略微灭菌(防止烤糊),然后用接种环蘸取一环菌种;
(5)划线:取已经备好的固体平板,边转动平板边用酒精灯火焰灭菌,打开平板(靠口朝酒精灯),用上述接种环在平板上划线,先在一侧连续划线3-4次,边转动平板边用酒精灯灼烧接种环,冷却后,用接种环穿过第一次划线部分继续划线3-4次,同样方法进行第三次划线,或第四次划线(根据菌液浓度和菌种类型确定划线次数),灼烧接种环;
(6)标记:在平板底部边缘处标记菌种名称,日期和其他信息;
(7)培养:放置于恒温培养箱中培养;
(8)保存:待培养完成后保存于4℃冰箱,待用。
4.操作技巧:
(1)甘油管菌种取出后,尽量不要放回去,或者标记清楚,反复冻融菌种效果不好。
(2)灼烧接种针时,一定要烧红。
要烧红!要烧红!要烧红!重要的事情说三遍,不烧红灭菌不彻底,容易污染,也可能出不来单菌落。
(3)烧红的接种针一定要冷却后再使用,如何确定接种针是否冷却?
用接种针沿着固体培养基内侧边缘或不可能用到的区域“轻点”,试一下固体培养基是否能够融化,如果融化,说明温度过高,继续冷却;如果不融化,说明接种针已经冷却,可以使用。
(4)甘油管菌种的浓度直接影响到划线区域的分布,如何确定甘油管菌种浓度?
第一种方法,事先查阅试验记录,确定甘油管菌种浓度。
第二种方法,借助显微镜观察,粗略判断甘油管菌种浓度。
第三种方法,测量吸光度,推测甘油管菌种浓度。
(5)划线过程,要求扫尾,扫尾出单菌落效果良好。
但是,在实际操作中,很少人扫尾,因为有时候看不清尾部在哪,直接在附近区域划线,效果也不错。
(6)一定要标记清楚菌种信息和划线日期,一般情况在培养皿底部边缘处标记。
5.注意事项:
(1)除样品外,所有试验都必须在无菌环境下进行,在打扫卫生、实验室消毒过程中,一定要做好个人防护。
(2)试验过程中,一定要正确使用酒精灯,避免着火。
(3)一定要在酒精灯旁边操作。
(4)试验结束一定要将无关物品从超净工作台中取出,该灭菌的物品一定要灭菌后再处理,避免交叉污染。
(5)试验过程中,尽量减少人员流动。
(6)试验过程中,避免手部接触平板边缘,以免造成污染。
(7)试验过程中,如果出现意外,比如说着火,别着急,拿上湿抹布覆盖即可。
二、涂布平板法
1.定义:
待分离微生物样品经过一系列梯度(一般10倍递增)稀释后,使微生物菌体充分分散,成为单细胞,然后再取出一定量,涂布到固体培养基表面的方法,再经过适宜的培养条件,形成单菌落的过程。
2.目的:
(1)获得纯培养物-目标菌。
(2)获得纯培养在微生物杂菌中的数量或比例—平板计数。
3.操作步骤:
梯度稀释步骤:
(1)称量:准确称取待测样品1g或量取待测样品1mL。
(2)稀释:将上述样品放入装有99mL无菌生理盐水(有小玻璃珠)的250mL三角瓶中,记录。
(3)摇匀:将上述三角瓶放置于摇床上振荡30min,使微生物细胞充分分散,静置20-30s,即成10-2稀释液。
(4)继续稀释:再用1mL无菌移液器,吸取上述稀释液1mL,移入装有9mL无菌水的试管中,吹吸3次,让菌液和水混合均匀,即成10-3稀释液。
(5)继续稀释:再换一支无菌移液器,吸取10-3稀释液1mL,移入装有9mL无菌水的试管中,吹吸3次,即成10-4稀释液。
(6)继续稀释:以此类推,连续梯度稀释,制成10-7、10-8、10-9等一系列稀释菌液。
涂布平板步骤:
(1)标记:将事先制备好的无菌平板上标记10-7、10-8、10-9,每一个梯度稀释设置三个重复。
(2)涂布:用无菌移液器分别吸取10-7稀释液0.1mL放入编号10-7的3个平板中,然后用涂布棒或涂布器将菌液在平板上涂抹均匀,每个稀释度用一个涂布器,用完涂布器酒精灯灼烧灭菌。
(3)继续涂布:同样涂布10-8稀释液和10-9稀释液,切记更换涂布棒。
(4)培养:将涂布好的平板平放于超净台上静置10min,使菌液渗透入培养基内,然后将平板放置于恒温培养箱中倒置培养。
(5)计数:至长出菌落后即可计数。
(6)保存:将单菌落平板储存至4℃保存。
计数原则:
(1)计数原则,平板上菌落数30-300个为合格。
(2)如果只有一个稀释度的平均菌落数,则以该稀释度平均菌落数除以涂布平板所用稀释液体积(0.1mL),乘以稀释倍数作为该样品的细菌总数。
(3)如果有两个稀释度的平均菌落数符合要求,则按照两者菌落总数之比来决定,如果小于2,取两者的平均值如果大于2,取较小的菌落总数。
4.操作技巧:
(1)前几个稀释梯度,尤其是第一个梯度适当放大稀释倍数。
这样不容易丢失目标菌,也可以很好地对样品进行溶解。
(2)学会使用玻璃珠。
玻璃珠的作用是研磨,尤其是粉末或颗粒性样品,可以将颗粒表面微生物与液体充分接触。
(3)勤换枪头或移液管。
这样不容易造成不同稀释度间混乱,防止不同梯度间取样不准。
(4)一定要摇匀。
平板涂布法的难点就在于稀释,稀释不准确后面一切都化为零,一定要摇匀再取样。
(5)利用显微镜粗略估测稀释倍数。
并不是每一个样品都需要稀释到10-9,而是要根据样品中微生物的数量进行稀释。
(6)涂布完成后,静置10min再倒置培养。
静置有利于微生物在培养基表面吸附,直接倒置培养,可能倒置菌液向一侧流动。
(7)倒固体培养基的时候,可以适当吹干或提前一到两天倒平板。
平板表面没有多余水分且比较湿润,涂布时候既容易涂开也不会造成出现菌苔。
5.注意事项:
(1)注意涂布力度,大小适宜,不应划破培养基的表面。
(2)如果发现平板上水太多,处理后再使用。
(3)切记写清楚标记。
(4)试验完毕,注意灼烧涂布器,以免影响环境,造成交叉污染。
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