2结果
2.1细胞裂解上清Westernblot分析结果显示，SiHa/M、SiHa/R组在4～6 Ku区域出现目的条带，而SiHa组无目的条带(图1)。
图1细胞裂解上清的Western blot分析
2.2mBD2对细胞活力的影响第1天SiHa/M、SiHa/R组与SiHa组比较，细胞活力差异无统计学意义(P=0.091)；第2、3天SiHa/M、SiHa/R组细胞活力明显高于对照组，差异有统计学意义(P=0.018)；第4、5天3组细胞活力差异无统计学意义(P=0.374)(图2)。
2.3mBD2对细胞凋亡的影响
2.3.1 AnnexinⅤ联合PI检测结果结果显示SiHa/M、SiHa/R及SiHa组AnnexinⅤ+/PI+双阳性细胞的百分率分别为2.4%、2.3%、2.3%，差异均无统计学意义(P=0.743)；AnnexinⅤ+/PI-细胞分别为0.9%、1.2%、1.5%，差异无统计学意义(图3)。
图2稳定转染细胞的细胞活力分析结果
2.3.2 TUNEL检测结果细胞大小形态不一，可见凋亡细胞胞核固缩浓染，核质致密，出现核边缘化，呈半月形；正常细胞胞核相对疏松，无核浓染现象(图4～6)。SiHa/M、SiHa/R组凋亡细胞发生率较高，分别为(40.6±4.67)%、(30.2±3.19)%，而SiHa组只有(7.4±1.94)%，SiHa/M、SiHa/R组凋亡细胞发生率明显高于SiHa组，差异有统计学意义(P=0.004)；SiHa/M组与SiHa/R组比较，SiHa/M组凋亡发生率高于SiHa/R组，差异有统计学意义(P=0.003)。
3讨论
机体对“非己”的免疫反应需要天然免疫和获得性免疫系统的协同作用。天然免疫反应不仅提供了抵抗微生物的第一道防线，同时也包含指导获得性免疫所必需的“危险信号”。防御素是宿主执行免疫防御能力的细胞所分泌的、具有杀微生物活性和细胞毒性的小分子多肽，提供直接、即刻的抗微生物效应以保护宿主免受入侵病原微生物损害，是固有免疫中重要的效应分子和调节分子，广泛用于抗菌、抗病毒等作用的研究。自首次报道防御素能裂解肿瘤细胞之后，不断有研究提示防御素与肿瘤免疫有关。研究表明，mBD2可与细胞表面CCR6受体结合，呈剂量依赖性的诱导未成熟树突状细胞(dendritic cells，DCs)CD34+祖细胞源性DCs的移动。进一步的研究显示，mBD2可与Toll样受体4(toll like receptor，TLR)结合，诱导骨髓源性DCs成熟。此外，由于肿瘤细胞膜表面特性发生改变而使得防御素能够与之结合并产生抗瘤作用也可能是防御素抗肿瘤的机制之一。防御素对肿瘤细胞的杀伤作用远大于非肿瘤细胞，但这种选择性杀伤的机制目前尚不清楚。
本研究通过细胞活力测定，显示SiHa/M、SiHa/R组细胞在贴壁后2～3 d细胞活性明显低于正常SiHa细胞。随后，随着细胞数目增加，培养液中营养物质消耗增加，细胞代谢产物堆积，细胞活性开始下降，提示mBD2蛋白对细胞活力有一定的抑制作用。这可能与防御素作用于细胞线粒体从而影响肿瘤细胞呼吸、导致细胞代谢紊乱、细胞活力下降有关。SiHa/M、SiHa/R组细胞活力比较，SiHa/M始终低于SiHa/R组，但两者差异无统计学意义，表明2种蛋白信号肽分子对蛋白活性影响不大。
本研究采用Annexin V联合PI法和TUNEL 2种方法测定转染细胞的凋亡情况。2种方法分别检测凋亡发生的不同时相，反映诱发凋亡的不同机制。采用AnnexinⅤ检测方法观察细胞凋亡，发现3组细胞凋亡指数无明显差别；采用TUNEL染色，结果显示SiHa/M、SiHa/R组凋亡细胞发生率较高，与对照组相比差异有统计学意义；SiHa/M组与SiHa/R组比较，SiHa/M组凋亡发生率高于SiHa/R组。
综上所述，可以认为mBD2蛋白所诱导的SiHa细胞凋亡主要以肿瘤细胞DNA出现断裂损伤为主，这与Hariton等研究结果一致。而由于细胞膜损伤导致PS外翻通过AnnexinⅤ检测方法未能得到验证，可能是由于早期凋亡所产生的PS外翻过程较为短暂，采用AnnexinⅤ未能捕捉到早期凋亡信号，故检测阳性率较低。由于SiHa/M与SiHa/R的主要区别在于两者所转染的质粒中插入序列信号肽区域基因有所不同，是否信号肽及其调控区序列在成熟肽形成中具有一定的调节功能，从而对成熟肽功能产生一定影响，还需实验进一步研究证实。
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