大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)是肠杆菌科(Enterobacteriaceae)埃希氏菌属(Escherichia)成员之一，一般不致病，多为条件致病菌。1894年，首次有了关于鸡大肠埃希氏菌的报道，随后世界养禽业发达国家和地区逐渐有了关于大肠杆菌病不同病型的报道，由多种致病因子结合的禽致病性大肠埃希氏菌(Avian pathogenicE.coli,APEC)，可导致禽类的多种症状，最常见的是死胚、败血症、心包炎、卵黄性腹膜炎、关节炎、气囊炎、肉芽肿等。由于临床上抗菌药物的长期、不合理使用，导致耐药菌株不断增多。因此，急切地需要新型药物的研发，以控制耐药性致病菌引起的感染。噬菌体是一种广泛存在于自然界中的病毒，对其宿主菌具有高效特异性的感染，并且不出现耐药性。近年来噬菌体已应用于临床疾病的治疗，并具有良好的效果。在现今鸡大肠杆菌病治疗的基础上，笔者以本实验室前期分离得的鸡致病性大肠埃希氏菌为宿主菌分离噬菌体，经过筛选得到一株裂解性噬菌体，分析了其部分其生物学特征，并进行了全基因组测序及分析，为该噬菌体用于临床治疗提供基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株和水样45株鸡大肠埃希氏菌均由石河子大学动物传染病实验室分离鉴定与保存，污水采于石河子市及周边养鸡场。
1.1.2主要试剂DNaseI、RNase A、Mung Bean Nuclease、病毒总基因提取试剂盒为TaKaRa公司产品；PEG4000为天津市科密欧化学试剂开发中心产品；SM缓冲液、PBS缓冲液、LB的液体/半固体/固体培养基均在石河子大学动科院传染病实验室进行常规配制所得。
1.1.3主要仪器高速冷冻离心机(Multifuge XLR)，美国赛默飞世尔科技有限公司产品；透射电子显微镜(HT7700)，日立(中国)有限公司产品；测序仪(Miseq)，美国Illumina公司产品。
1.2方法
1.2.1宿主菌的准备将本实验室保存于-80℃超低温冰箱中的45株鸡大肠埃希氏菌置于4℃环境下解冻。挑取在LB固体平板上划线生长出的单一菌落分别接种于5 mL液体LB培养基中，于37℃、160 r/min条件下过夜富集培养，后置4℃保存。
1.2.2噬菌体的分离与纯化
将污水水样依次经过无菌纱布和滤纸过滤，得到的滤液置于4℃过夜后，再用0.22μm滤膜过滤除菌。取除菌的污水滤液与45株鸡大肠埃希氏菌各菌悬液依次加于液体LB培养基中，于锥形瓶中混匀，室温静止15 min，37℃、160 r/min培养7 h并于4℃过夜，10 000 r/min离心10 min，取上清液分别与45株鸡大肠埃希氏菌菌悬液混合吸附后，用双层琼脂平板法过夜培养进行噬菌体的分离。
用无菌牙签挑取生长良好的单个噬菌空斑至于100μL相应宿主菌，吸附反应15 min，加入5 mL液体LB培养基中，振荡培养5 h，将离心倍比稀释的培养液与宿主菌混合均匀后采用双层琼脂法培养，如此过程重复3次以上，直至在一个平板上形成形态单一的噬菌斑。即可得到纯的噬菌体原液，将其置于-80℃(与500 mL/L甘油等体积混匀)保存和4℃备用。
1.2.3噬菌体的浓缩及电镜观察
采用超速离心法，进行噬菌体浓缩，将裂解液上清在4℃下24 446×g，离心1.5 h，用SM缓冲液轻轻洗脱重悬每个离心管中的沉淀，最后将得到的浓缩液收集在1.5 mL无菌离心管中保存于-80℃备用。取20μL噬菌体浓缩液滴于载玻片上，用精细镊子轻轻夹取铜网(200目)放于噬菌体浓缩液液滴上，室温下吸附2 min后取出，放于吸水纸上，去除铜网上的液体，滴一滴20 g/L的磷钨酸染液在铜网上，静置染色3 min取出，放于吸水纸上，用红外灯照射30 min，以彻底除去水分与有害杂质后，用HT7700透射电子显微镜观察噬菌体的形态。
1.2.4噬菌体核酸类型的鉴定
噬菌体基因组的提取严格按照病毒基因DNA/RNA提取试剂盒说明书中的操作步骤进行，将提取的核酸于37℃水浴条件下，用DNaseⅠ、RNase A与Mung Bean Nuclease分别对噬菌体的基因组消化2 h后，采用琼脂凝胶电泳法对消化产物进行检测。
1.2.5噬菌体全基因组的测序
将噬菌体基因组处理为约290 bp的测序文库，利用Miseq测序仪完成测序工作，使用软件Newbler 2.9与CLC 3.0对得到的基因组序列进行序列组装。测序工作由北京军事医学科学院微生物学流行病学研究所完成。利用MEGA7.0对所得序列进行亲缘关系的构建。