1.6.2乙醚敏感性试验
取2 mL病毒液与0.5 mL乙醚混匀置4℃过夜，次日900×g离心30 min，吸取下层病毒液并过滤除菌，于MDBK细胞中测定TCID50。
1.6.3氯仿敏感性试验
病毒液以2400×g离心30 min去除细胞碎片，取1.2 mL上清与200μL氯仿混匀置4℃过夜，次日取上层病毒液并过滤除菌，于MDBK细胞中测定TCID50。
1.6.4胰蛋白酶敏感性试验
取1 mL病毒液与等体积0.5%胰蛋白酶溶液混匀（胰蛋白酶终浓度为0.25%），置37℃作用1 h，立即加入4 mL胎牛血清以终止胰蛋白酶的作用，过滤除菌后于MDBK细胞中测定TCID50。
1.6.5耐酸耐碱性试验
分别取2 mL病毒液，将其pH调至3.0、5.0、9.0和10.0，置于37℃水浴中作用1 h，再将pH调至7.0，过滤除菌后于MDBK细胞中测定TCID50。
1.6.6温度敏感性试验
各取1 mL病毒液，分别置于50℃和56℃水浴中作用30 min。各取1 mL病毒液与等体积MgSO4（终浓度1 mol/L）混匀，分别置于50℃、56℃水浴中作用30 min。处理后的病毒液均于MDBK细胞中测定TCID50。
1.7病毒的细胞嗜性
将分离的病毒NM575株分别接种于MDBK、BHK-21、PK-15、MDCK、Vero-E6、CEF、Marc145等细胞中，逐日观察，出现CPE及时收毒。收获的病毒液于MDBK细胞中测定TCID50。
1.8病毒一步生长曲线
将分离毒株NM575按100 TCID50/0.1 mL分别接种于MDBK细胞6小瓶，吸附1 h。用PBS洗去未吸附的病毒，加入维持液，于5%CO2、37℃培养。分别于接毒后3、6、12、24、36、48 h收毒，收获的病毒液于MDBK细胞中测定TCID50，绘制生长曲线。
1.9 RT-PCR检测
参考GenBank中登录的牛肠道病毒BJ001株（HQ663846）全基因组序列，设计并合成特异性扩增P1基因的引物，引物序列为：P1F：5'-C C A A C T G A A C C T G G C G T A T-3'，P 1 R：5'-GACTGTAGCCCGAAATCCC-3'。预期扩增片段大小为1338 bp。
按照AXYGEN病毒RNA小量提取试剂盒方法提取病毒基因组RNA。用下游引物作为反转录引物将RNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板，进行P1基因的扩增。PCR扩增条件为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，50℃退火45 s，72℃延伸3 min，共30个循环；72℃再延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。将扩增片段进行胶回收，与PMD-18T载体连接，并转入感受态DH5α中，经培养后挑取单个菌落，摇菌后送吉林库美公司测序。测序结果与GenBank中登录的BEV参考毒株序列进行比较，利用MAGE6软件进行同源性分析，并绘制遗传进化树。
2结果
2.1病毒的分离结果
30份鼻拭子接种MDBK细胞后，第1代有1个样品出现CPE，表现为细胞圆缩集聚并突出于底层细胞表面，随着时间的推移，细胞破裂。进行病毒分离，获得的毒株命名为NM575。其他样品盲传后未见CPE。对照组细胞生长良好（图1）。
图1病毒分离株NM575在MDBK中引起的细胞病变
2.2电镜观察结果
病毒分离株NM575接种MDBK细胞的上清，经电镜负染可观察到无囊膜的球形病毒粒子，直径大小约30 nm，与小RNA病毒粒子的特征相符（图2）。
图2分离株NM575病毒粒子电镜图
2.3病毒的理化特性
100µg/mL的DNA抑制剂5-溴脱氧尿苷（BRDU）不能抑制分离株NM575的增殖，能够抑制DNA病毒IBRV，不能抑制R N A病毒B P I V 3，且对M D B K细胞无毒性，由此可判定该毒株为R N A病毒。分离株N M 5 7 5细胞培养物经乙醚、氯仿及胰蛋白酶处理后，TCID50与对照组比较无明显差异，表明分离病毒对脂溶剂及胰蛋白酶有一定的抵抗能力。耐酸耐碱试验结果显示，该病毒可抵抗pH3.0的酸性环境，但对pH9.0的碱性环境敏感。50℃30 min可使该病毒活性明显下降，56℃30 min可使病毒失活，表明该病毒对热敏感。在病毒培养物中加入终浓度为1 mol/L MgSO4后，经50℃或56℃30 min作用后其TCID50无明显变化，说明二价阳离子（如Mg2+）可提高分离病毒对高温环境的抵抗力（图3）。
图3分离病毒株NM575理化特性鉴定结果
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