研究简介：有效的定殖对于微生物对其宿主发挥潜在的有毒或有益功能是必要的1。由于土壤微生物的高度多样性和激烈竞争，快速定殖对于土壤细菌占据根部营养丰富的生态位非常重要。植物根际促生长细菌（PGPR）由于其多功能的植物有益特性而被广泛应用于农业生产中。铁在植物生长、发育和防御中发挥着关键作用，也是根际中的有限资源，其中栖息的微生物争夺这种必需的矿物质营养素。植物病原体从宿主细胞中回收铁，而植物则利用铁保留策略来对抗病原体感染。贝莱斯芽孢杆菌SQR9是一种经过充分研究的PGPR，它可以在根部定殖，通过促进生长和控制疾病来使植物受益。贝莱斯芽孢杆菌SQR9使用铁载体和特定的铁ABC转运蛋白来获取铁，从而支持生物膜形成和根部定殖。为了与宿主建立相互作用，一系列与动物和植物相关的病原菌和共生细菌已经发展出独特的分泌系统，将某些蛋白质跨膜或疏水结构转移到细胞外空间。在这些系统中，VII型分泌系统（T7SS）是厚壁菌门和放线菌门所独有的。最近的研究表明，EsxA（结核分枝杆菌T7SS分泌的核心蛋白）在T7SS介导的毒力中发挥着核心作用，包括吞噬体膜的扰动。T7SS在芽孢杆菌属物种15中也是保守的，其中yuk/yue操纵子编码用于分泌YukE的T7SS，YukE与分枝杆菌中的EsxA同源。研究人员发现贝莱斯芽孢杆菌SQR9的T7SS及其分泌蛋白YukE导致植物根部铁渗漏，这有助于贝莱斯芽孢杆菌SQR9在根部定植。研究进一步发现，T7SS分泌的YukE可能通过直接插入根质膜而导致根部铁渗漏。
Bioscreen全自动生长曲线分析仪的应用
Bioscreen C全自动生长曲线分析仪主要用于测量B.velezensis SQR9及其衍生菌株的生长曲线。Bioscreen C系统通过每小时测量OD600值来监测细菌在LB培养基或修改后的MSgg培养基中的生长情况。这种监测是自动化的，可以连续记录细菌的生长情况，为研究者提供了关于细菌生长动态的详细信息。通过使用Bioscreen C全自动生长曲线分析仪，研究者能够评估不同条件下（如在不同铁浓度的培养基中）B.velezensis SQR9及其衍生菌株的生长能力。这对于理解T7SS和YukE在细菌生长和铁获取中的作用至关重要，因为铁是细菌生长的关键营养素。此外，通过比较野生型和突变株的生长曲线，研究者可以评估T7SS和YukE对细菌生长的影响。
实验结果
T7SS和YukE对于B.velezensis SQR9在植物根部的定植至关重要。通过基因敲除实验，研究人员发现缺失T7SS或YukE的突变株在根部定植能力上显著下降。YukE能够插入植物的细胞膜，导致根部铁泄漏。这种铁泄漏在植物与SQR9的相互作用中起到了促进作用，因为铁的可用性增加有助于SQR9的定植。提出了YukE通过直接插入植物根细胞膜来引起铁泄漏的机制。这一过程在接种初期最为显著，且在24小时后逐渐减弱。通过铁染色和ICP-MS技术，发现WT SQR9处理的植物根部铁含量显著降低，而YukE的突变株或热处理YukE无法复制这一效应。在高铁环境下，T7SS的表达和YukE的分泌增加，表明铁水平可能通过正反馈机制调节YukE的产生和活性。YukE能够引起根部铁泄漏，但它对植物生长没有负面影响，甚至可以增强SQR9对黄瓜生长的促进作用。揭示了贝莱森巴伯菌SQR9的T7SS及其分泌蛋白YukE导致植物根部铁渗漏，从而促进贝莱森巴伯菌SQR9在根部定殖。
图1、贝莱斯芽孢杆菌SQR9和tT7SS对根定植的贡献。a）编码T7SS的yuk/yue操纵子的示意图。红色箭头表示编码分泌型WXG100家族蛋白YukE的基因，绿色箭头表示编码输出机制的基因。b）基于72个RNA-seq数据集的yuk/yue操纵子的转录相关性。计算皮尔逊相关性；颜色表示每对基因之间转录相关性的R值：黄色表示高相关性，蓝色表示低相关性。c）培养物上清液和细胞裂解物的蛋白质印迹测定。d）上清液和细胞裂解液中YukE的含量。测量一份样品的整个培养物、上清液和细胞裂解物，并记录OD 600以指示细胞密度。数据以平均值±sem（n=6）表示。虚线表示5µM纯化的YukE-GFP的荧光密度。e,f）WT SQR9、突变体和互补菌株在水培环境中生长的拟南芥(e)和黄瓜(f)根上的定殖。在接种后第2天测量定植的细菌细胞。
图2、SQR9衍生菌株和YukE对植物铁含量的影响。a）接种B.velezensis SQR9或用YukE处理的15天龄拟南芥根的Perls染色图像。b）接种后24小时，15天龄拟南芥根部铁的Perls染色的显微镜视图。对于每次处理，检查12个根的成熟区。c）b中Perls染色的定量分析。d–f）ICP-MS测量用YukE或SQR9衍生菌株处理的15日龄拟南芥根部在12小时(d)、24小时(e)和48小时(f)时的铁含量。接种后P=0.815。g）通过ICP-MS测量接种后12小时，YukE梯度剂量对15日龄拟南芥根铁含量的影响。h）接种后24小时K252a和BFA对YukE根细胞降铁能力的影响。
图3、YukE介导的根部铁渗漏有助于SQR9的根部定殖。a）水培条件下，接种后2天，B.velezensis SQR9在15天龄的拟南芥根上定殖。b)接种后24小时，15日龄拟南芥根际细菌细胞获得的铁的ICP-MS测量。将野生型SQR9或突变体接种到含有常规铁(90μM)的中等生长的15天龄拟南芥植物中。分别在接种后0小时和24小时通过剧烈洗涤和离心收集细菌细胞。细菌铁获取量计算为接种后24小时的铁含量减去接种后0小时的铁含量。c)ICP-MS测量体外细菌细胞的铁含量。用5μM YukE处理15天的拟南芥植物12小时以防止铁渗漏。
图4、YukE在15天龄拟南芥细胞表面的功能和位置。a）接种或处理后24小时YukE在根表面的位置。用B.velezensis SQR9 yukE::yukE-gfp（终浓度为107个细胞/ml）接种拟南芥根，或用纯化的YukE-GFP（终浓度为5μM）处理。包括对根部进行剧烈清洗步骤以去除未附着的细菌细胞和蛋白质。b）a中所示的GFP和FM4-64信号的共定位分析。括号中的数字表示根据a中的所有重复计算得出的标准误差。c）接种后48小时YukE在根表面的位置。比例尺，100μm。d）c中所示的GFP和FM4-64信号的共定位分析。e）接种后2天，YukE-GFP和质膜标记PM-mCherry在本塞姆氏烟草叶细胞中的共定位。包括三个生物学重复。比例尺，100μm。该实验重复两次，结果相似。f）e中所示的GFP和RFP信号的共定位分析。g）YukE对PI染色根细胞核的影响。
图5，YukE插入植物质膜。a、b）接种后24小时，YukE变体对PI根细胞核染色(a)和铁Perls染色(b)的影响。每幅图像下方的分数表示细胞核被PI染色的次数。比例尺，100μm。蓝色染色代表铁。c）接种后12小时用YukE变体处理的15天龄拟南芥根部的铁含量的ICP-OES测量。d）AlphaFold 2预测的YukE的3D结构。黄色残基表示用NBD标记的用于测试质膜插入的位点。e，f，荧光共聚焦显微镜检测到YukE在叶（e）或根（f）原生质体上的膜插入。图像是在混合后15小时拍摄的。每个处理包括三个重复。比例尺，20μm。该实验重复两次，结果相似。g,h，e(g)和f(h)中微观视图的定量分析。i，NBD标记的YukE变体在人工脂质体上插入的定量分析。j，从脂质体释放的铁的定量分析。
总结
本研究主要探讨了植物共生菌Bacillus velezensis SQR9的VII型分泌系统（T7SS）及其主要分泌蛋白YukE在促进植物根部定植中的作用。研究揭示了T7SS和YukE在根际细菌与植物相互作用中的重要性，特别是在铁这一关键营养元素的获取和利用方面。研究发现YukE能够插入植物细胞膜，导致根部铁泄漏，从而为B.velezensis SQR9的定植提供有利条件。这种铁泄漏在植物与SQR9的相互作用中起到了促进作用，因为铁的可用性增加有助于SQR9的定植。此外研究还发现YukE的分泌和活性受到铁水平的调节，表明铁水平可能通过正反馈机制调节YukE的产生和活性。通过基因敲除实验，研究者发现缺失T7SS或YukE的突变株在根部定植能力上显著下降，进一步证实了T7SS和YukE在B.velezensis SQR9根部定植中的关键作用。此外，研究还探讨了环境铁水平对YukE分泌和T7SS表达的影响，发现在高铁环境下，T7SS的表达和YukE的分泌增加。这项研究不仅增进了研究人员对植物共生菌如何通过T7SS和YukE与植物相互作用的理解，而且对于农业生产和植物健康具有潜在的应用价值。在本论文研究过程中，Bioscreen C全自动生长曲线分析仪的使用为研究提供了一个高效且准确的方法来监测细菌生长，这对于理解细菌与植物相互作用的分子机制以及开发潜在的农业应用具有重要意义。通过这种分析，研究者可以更好地理解T7SS和YukE在植物共生菌与植物相互作用中的作用，以及它们如何影响植物的铁营养和根部微生物相互作用。本研究发现还有助于研究人员更好地理解植物根部微生物群落的动态变化，为根际工程和植物微生物组研究提供了新的视角。