玉米大斑病(Northern Corn Leaf Blight)是由玉米大斑病菌(Setosphaeriaturcica)所引起的以叶部产生大型病斑症状为主的玉米病害,其分布广、危害重,是世界性的真菌病害[1-2]。玉米大斑病菌利用无性分生孢子传播,以侵染性菌丝在玉米寄主组织内扩展,并通过产生HT毒素(Helminthosporiumturcicumtoxin)抑制寄主的防御体系,从而引起病害症状[3-4]。MAPK信号转导途径对玉米大斑病菌分生孢子萌发、附着胞产生、致病性和HT毒素活性都有重要的调控作用[5-8]。巩校东等[9-10]研究发现,玉米大斑病菌至少存在Hog1、Slt2、Fus3/Kss1和Ime2等4条MAPK途径。谷守芹[11]利用候选基因法克隆了3个MAPK基因STK1、STK2和STK3,其中STK1基因属于Hog1-MAPK途径,主要与渗透胁迫和应激胁迫调节有关;STK2基因属于Slt2-MAPK途径,主要与病原菌的致病性和孢子发育有关;STK3基因属于Fus3/Kss1-MAPK途径,主要与细胞壁合成有关。Li等[12]研究发现,STK1基因不仅调控玉米大斑病菌的渗透胁迫调节,而且与菌丝、分生孢子和附着胞发育、毒素合成及致病性都有关。因此,STK1基因是调控玉米大斑病菌生长、发育和致病性的重要MAPK基因。


王梅娟等[13]研究发现,在1.0 mol/L NaCl高渗胁迫条件下玉米大斑病菌生长受到抑制,甘油浓度增加,同时STK1基因的表达量稳定增加,从而明确甘油是玉米大斑病菌主要的一种渗透调节物质。谷守芹[11]和Li等[12,14]的研究也证明,在NaCl、KCl、LiCl等盐胁迫条件下STK1基因具有重要的渗透调节功能。植物病原真菌进化了多条信号应答途径来适应环境中的渗透压变化,其中高渗透性甘油促分裂原激酶信号转导途径(HOG-MAPK)是植物病原真菌中最主要的渗透胁迫调节途径。该途径通过促进甘油积累、延缓细胞生长及调节其他生理条件抵抗渗透胁迫刺激[15]。在稻瘟病菌(Magnaportlregrisea)、炭疽病菌(Colletotrichnnrlagenarinm)、稻平脐蠕孢菌(Bipolarisoryzae)、栗疫病菌(Cryphonectriaparasitica)、小麦壳针孢(Mycosphaerellagraminicola)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerca)等植物病原真菌中均发现MAPK途径,并克隆了相应的Hog-MAPK同源基因[16]。但是在植物病原真菌高渗胁迫研究中,主要研究的是盐胁迫对生长、发育和致病性的影响,对山梨醇等有机分子的渗透胁迫研究却鲜见报道。


本研究利用玉米大斑病菌STK1基因的敲除突变体(knockout mutants,KO),比较该突变体与野生型菌株(WT)在山梨醇胁迫下菌落生长速度、菌丝形态及脂类物质在菌丝细胞内沉积情况等方面的差异,分析玉米大斑病菌在山梨醇高渗胁迫下的渗透调节机制,为进一步明确STK1基因对玉米大斑病菌渗透胁迫调节的分子机理,以及STK1基因在玉米大斑病菌生长、发育和致病性等方面的调控功能奠定基础。


1材料与方法


1.1供试菌种


玉米大斑病菌野生菌株(WT)01-23及其STK1基因敲除突变体(KO)STM-35,均由河北农业大学谷守芹教授提供。


1.2试验材料和供试培养基


油红O染液[17]:取油红0.5 g,加异丙醇至100 mL,60℃水浴中加温溶解30 min,配成油红O储备液,置于棕色小磨沙口瓶保存。临用前取0.6 mL油红O加蒸馏水0.4 mL,混合静置10 min后用0.45μm滤膜过滤除菌。


PDA培养基:马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂粉12 g,水1 000 mL。


DPA培养基:葡萄糖20 g,蛋白胨5 g,琼脂粉12 g,水1 000 mL。


1.3试验方法


1.3.1菌株培养和活化将试管内保存的野生菌株01-23和突变体STM-35分别接种到PDA培养基上,25℃黑暗倒置培养6 d后,再次转接到PDA平皿上,培养至菌落直径达到5 cm左右。


1.3.2适宜高渗胁迫分析培养基的筛选将野生菌株01-23分别接种于PDA和DPA培养基上,25℃黑暗倒置培养6 d后,挑取菌丝于洁净载玻片上,滴入适量PBS缓冲液,置于显微镜下观察。


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