2结果


2.1阴沟肠杆菌2025菌落形态


三区画线菌落形态如图1所示,LB培养基菌落(左)形态光滑湿润,呈圆形灰白色;APW培养基(右)形态光滑湿润、呈灰白色、生长状况较LB培养基更为旺盛。

图1阴沟肠杆菌2025菌落形态


2.2阴沟肠杆菌2025 16S rRNA系统发育树


将分离菌株16S rRNA测序序列与NCBI网站BLAST在线软件进行比对,结果显示,分离菌株与阴沟肠杆菌strain RCB 980的16S rRNA序列相似度高达98.88%。通过系统发育树可以看出,分离菌株菌种为阴沟肠杆菌,并将其命名为阴沟肠杆菌2025(图2)。

图2阴沟肠杆菌2025 16S rRNA系统发育树


2.3阴沟肠杆菌2025药物敏感性试验


34种抗生素比对结果显示(表1),阴沟肠杆菌2025对16种抗生素产生耐药性,包括青霉素G、红霉素及万古霉素等;对亚胺培南、卡那霉素及四环素等7种抗生素耐药性为中介;对其余11种抗生素表现出高敏感性,包括庆大霉素、诺氟沙星及环丙沙星等。


表1阴沟肠杆菌2025 34种抗生素药物敏感性试验结果


抗菌药物抑菌圈直径折点/mm抑菌圈直径/mm敏感性


耐药(R)中介(I)敏感(S)


青霉素G≤28-≥29 0 R


苯唑西林≤10 11~12≥13 0 R


氨苄西林≤11 12~14≥15 0 R


羧苄西林≤19 20~22≥23 22 I


哌拉西林≤17 18~20≥21 27 S


头孢氨苄≤14 15~17≥18 11 R


头孢唑啉≤14 15~17≥18 0 R


头孢拉定≤14 15~17≥18 12 R


头孢呋辛≤16 17~19≥20 18 I


头孢他啶≤14 15~17≥18 23 S


头孢曲松≤13 14~20≥21 29 S


头孢哌酮≤15 16~20≥21 18 I


亚胺培南≤13 14~15≥16 14 I


痢特灵≤14 15~16≥17 13 R


阿奇霉素≤13 14~17≥18 11 R


麦迪霉素≤13 14~17≥18 0 R


红霉素≤13 14~22≥23 0 R


庆大霉素≤12 13~14≥15 15 S


新霉素≤12 13~16≥17 15 I


卡那霉素≤13 14~17≥18 15 I


丁胺卡那≤14 15~16≥17 14 R


左氧氟沙星≤13 14~16≥17 27 S


诺氟沙星≤12 13~16≥17 20 S


环丙沙星≤15 16~20≥21 30 S


复方新诺明≤10 11~16≥17 0 R


万古霉素≤14 15~16≥17 0 R


多黏菌素B≤8 9~11≥12 15 S


四环素≤14 15~18≥19 17 I


多西环素≤12 13~15≥16 16 S


米诺环素≤14 15~18≥19 12 R


氯霉素≤12 13~17≥18 23 S


克林霉素≤14 15~20≥21 0 R


链霉素≤11 12~14≥15 11 R


氟苯尼考≤12 13-17≥18 27 S


2.4噬菌体ZX14形态表征


噬菌体ZX14噬菌斑直径约1 mm,外无晕圈(图3A)。透射电子显微镜下观察,噬菌体ZX14有二十面体的头部和可收缩的尾部,头部长度约100 nm,头部直径约75 nm,尾部长度约100 nm,尾部直径约20 nm(图3B)。

图3噬菌体ZX14噬菌斑形态及透射电子显微镜观察


2.5噬菌体ZX14生物学特性测定


最佳MOI的测定可以反映噬菌体裂解速率。如图4A所示,当MOI=1时,噬菌体ZX14效价最高,达到2.5×109 PFU/mL。一步生长曲线是噬菌体裂解周期的最佳体现。通过一步生长曲线来确定噬菌体ZX14的潜伏期和裂解期。如图4B所示,噬菌体ZX14在0~20 min效价无明显变化,表明其潜伏期为20 min,20~80 min效价开始明显上升,表明其裂解期为60 min。经计算可得裂解量为45 PFU/cell。

图4噬菌体ZX14一步生长曲线(A)与最佳MOI(B)测定


2.6噬菌体ZX14稳定性鉴定


热稳定性测试显示(图5A),噬菌体在37~50℃环境下活性稳定。在60℃下孵育20 min、40 min和60 min后,噬菌体滴度分别由5×108 PFU/mL降至2×107 PFU/mL,2.4×106 PFU/mL和3.5×106 PFU/mL。在70℃下孵育20 min后,噬菌体活性完全丧失。

图5噬菌体ZX14稳定性曲线


如图5B所示,噬菌体ZX14在pH 5~12缓冲液中处理1 h能保持活性稳定,效价均≥5×108 PFU/mL。pH 7时效价最高,为1.5×1010 PFU/mL,在pH 12时,效价降低为5×108 PFU/mL,pH 5时,效价降低为8×108 PFU/mL,在pH≤3和pH≥13时完全失活。


ZX14在氯仿体积比为0.2%、0.5%、1%、2%、3%、4%时效价仅在1×1010 PFU/mL与1×1011 PFU/mL之间轻微波动,表明噬菌体ZX14有着良好的氯仿耐受性(图5C)。


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